哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物研究进展

开发了自己的哺乳动物表达载体，主要添加了一些其它的元件以增加目的基凼的
表达水平，如ｐＳＳｌ８５质粒引入ＨＩＶ病毒的转录活性元件ＴＡＴ／ＴＡＲ，ｐＴＴ质粒则引 入腺病毒的内含子剪接元件以增加ｍＲＮＡ稳定性和蛋白质翻译速度。 ～旦克隆细胞系获得后，必须对其蛋白质表达的稳定性作出评价。由于基因 的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。导致基因沉默的主要原因是目的
在过去的２０多年中，哺乳动物细胞制备重组蛋白技术发生了巨大的变化。主
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要表现在（１）细胞培养时间延长，由过去的７天延长至２１天；
（２）细胞密度
（３）
增加，由过去的卜２Ｘ１０６细胞／毫升，增加到现在的卜１．５Ｘ１０ ７细胞／毫升；
产量增加，过去为１０—２０ｐｇ重组蛋白／细胞／天，５０一１００ｍｇ重组蛋白／升，而现在 则为５０－９０ｐｇ重组蛋白／细胞／天，卜５９重组蛋白／升。这些变化的主要原因是人
养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗牛物反应器剪切力，提供细胞贴
壁所需的丛质，作为脂类和其他生长凶ｒ的绒体等。 实验室【｛Ｊｔ活｜１用商业化的Ⅲ离了脂质转染试剂实施质粒对ｌ｝｜ｌｊ乳动物细胞的转 染，蹲经筛选得到稳定表达的：煎ｆｌ［ｆｌｔｌ胞株。这种转染试剂转染效率很高，但价格 不二｛Ｅ，限书４了人规模培养时瞬时表达ｆ：艺ｔｌ，的应Ｊ玎。日ｄ玎有两种试剂（磷酸钙和 聚乙烯业胺）町以满足火规模培１：１７）ｏｒ瞬时表达一１，的应用，它们价格便宜，可作为人 规模培养瞬时表达之ＩＩｊ。ｌ ９９５年Ｂｏｕｓｓ ｉｆ等浮先发现聚乙烯ｑｌＳ＿ｌｔＴｉ足…种在体内 刷体外均仃效的质粒Ｉ）ＮＡ转运载体，并靠＾冬１人ｌ治，，ｔｌ ｃ得到Ｊ娅ｆ疆。聚乙烯贬胺ＰＥＩ 弓质粒１）；＼Ａ形成带Ｉ即乜衙颗粒，称为ｐ（Ｊｌ ｙｐｌｅｘｅｓ，垒ｌ｜ＪＪ｛生袭㈨＂，ｉｌ＂ｌｉ，ｔ－负电衙的糖篮｝，－ｊ 可以作为ｐ‘）】ｙｐ］ｅｘｅｓ的受体，并Ｌｊ之给合形成复合物，通过细胞胞吞ｆｌａｉｌ］或者 怒通过ＣＩａｔｈｒｉｎ／ｃａｖｅ０１ ｉ ｎ介导的内备ｆｉｌｌＪ进入细胞内，然后复合物解聚，质粒 １）ｆ＇，ｉＡ进入细胞核。ＣｌＩＯ和ｔ１ＥＫ２９３细胞的瞬时．垠Ｗ表达（，ｌ’（；Ｆ）Ｌ｝１常刚分ｆ遂为２５ＫＤａ 的线性㈨ｌ作为基洲转移载体。磷酸钙介．导的毖斟转移扫：无向．ｉ占培养雏巾使用时 要多Ｄｉｌｄ，心，因为无缸清培养摹中含有低浓度的钙离‘ｆ，必要时应在转染前通过 离心或移ｅ淀法更换培养缺。
ｃｌｏｎｅＰｉＸ
ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｔｄ．）ａｎｄ
Ｃｅｌ
１Ｃｅｌｅｃｔｏｒ。对这些仪器而言，使用的
前提是假定重组细胞被重悬于半固体的培养基中。在这样的条件下，分泌性的重
组蛋白处于细胞的附近，可以被荧光标记的抗体染色，这些自动化系统能检测和 筛选重组细胞系以作进一步研究。 ｔ１ＥＫ２９３细胞（Ｈｕｍａｎ
哺乳动物细胞表达载体，它含有人巨细胞病毒的ＣＭＶ启动子。驱使目的皋因表达
的启动了是表达载体的关键凶素，人臣细胞病毒的早期皋冈肩动子和增加子
（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）是最常用的启动子。也有采用鼠ＣＭｖ启动子、人／鼠源巨 细胞病毒杂交的ＣＭＶ启动予和延长因子ｌ
Ｑ（ＥＦｌ
Ｑ）的启动予。一些实验寮也
的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达２０吨。为了节约成本，减少动物血清 对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同 细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如Ｕ１ｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ，ＰｒｏＣＨＯ，Ｐｒ０２９３等。
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大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋ｆ１和调节葡萄糖摄取量的 胰岛素，以及一些蛋一质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋自等，这止警蛋自在细胞培
基因所插入位点染色体的结构。异染色质区ＤＮＡ较浓缩，转录不活跃，而常染色
区较松驰，转录活跃。染色体的这两种状态与组蛋白的修饰（乙酰化、甲基化、 磷酸化）有关，蛋白修饰控制了染色体的浓缩和转录活性。大约有５０％的重组细 胞在选择性压力移去后的数天内就会发生快速沉默，而大约有３０％的细胞会选择 性压力移去后的６个月内就会逐渐减少目的基因的表达，称为慢沉默。最后大约
８０年代，哺乳动物细胞生产罩组蛋白质的研究｝要在旋转培养瓶中进行，
由于这些容器体积较小，仪有约５０毫升，另外这种容器的液相体积传质系数 （Ｋｌａ）约为２－３／ｈ，最大的细胞密度仅为２＂３Ｘ１０６
ｃｅｌ ｌｓ／ｍｌ。因此，旋转式小
瓶细胞培养不适用于大规模培养。轨道式振摇瓶，约５０ｍｌ体积的通气瓶，作为 一种小规模哺乳动物细胞培养装置，细胞密度达到１０７细胞／ｍｌ，在适当的搅动 速度下，Ｋｌａ可以达到１０—２０／ｈ。由于具有良好的传质系数，可以有效地克服氧 对高密度细胞培养的限制，这种装置可作为实验室规模的前期研究。 目前大规模哺乳动物细胞培养绝大数是在不锈钢搅拌式反应罐中进行的，现
ｏｖａｒｙ）细胞系。ＣＨＯ细胞足第一批采用的宿主细胞，是一种＿二氢叶酸还原酶营
养缺陷型细胞株。蟹白质制备过程中所采用的ＣＨＯ细胞于１９５７年山Ｐｕｃｋ等人将 原代培养的中围仓鼠卵巢细胞的永４ｉ化而获得。ＣＨＯ—Ｋｌ足由原始ＣｔｔＯ细胞衍生 的甘氨酸依赖型细胞株，并经进一步突变产牛为Ｃｌｌ沪ＤＸＢｌ ｌ，也称为ＣＩＩＯ－ＤＵＫＸ 或ＣＨＯ－ＤＵＫ－ＸＢＩ ｌ，这是一株ＤＨＦＲ缺陷型细胞株，这些细胞中已删除了一个ｄｈｆｒ 等位皋因，另一个等位基凶则产生了错义突变。ＣＨＯ－ｐｒ０３一细胞株为脯氨酸依赖 型细胞株，它被突变产生为ＣＨＯ～Ｄ（；４４，该细胞株则删除了ｄｈｆｒ的两个等位基因。 这些Ｄ１１ＦＲ缺陷细胞株需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧Ｉ赃作为生长补允原料。 虽然ＣＨＯ细胞最初并不足为了用。『．表达重组蛋白而制备的，ｆＨ ＤＩｔＦＲ删除的 ＣＨＯ细胞易于制作稳定的转基凶细胞株。采Ｊ１ｊ外源ｄｈＩ、ｒ与目的基闻共转染，通 过ＧＨＴ缺少培养基可以筛选剑稳定的转染细胞株。这已成为一项标准的遗传筛选 方法，首先是将目的基因和ｄｈｆ’ｒ克隆在Ｉ司一表达载体或个别的表达载体。载有 两个基凶的质粒被转染到宿主细胞中，然后让细胞￡卜长在选择性培养基（缺少 ＧＨＴ）中。每一个存活细胞的染色体中将有一个或多个拷贝的外源日的基冈和 ｄｈｆｒ。不同的重组细胞株整合的质粒拷贝数不尽相Ｉｒｄ，但它们整合的位点往往则 是相同的。每一个细胞株的生长速率和罩组蛋白质的表达水平有很大的变化。一 般要对成百上千个细胞株进行筛选和评价，才能得到高产稳定的重组细胞株。ＭＴＸ （氨甲蝶呤，ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）能抑制ｄｈｆｒ基因表达产物的活性，当表达外源ｄｈｆｒ 的重组细胞ＣＨＯ株，在含有高浓度的ＭＴＸ培养基中，绝大数的细胞会在２—３周内 死亡，仅有少数整合有高拷贝的重组质粒的细胞株爿‘能存活。目的基因一般与 ｄｈｆｒ相伴随而整合，因此可以用此法筛选得到高拷贝含有目的基因的重组细胞 株。 根据共转染重组原理，新的筛选方法是采用荧光激活细胞分检技术（ＦＡＣＳ）。 将ＧＦＰ蛋白与目的基冈共转染，然后利用ＧＦＰ特异性荧光分检技术，获取产荧光 细胞株。也可将目的基因与编码细胞表面蛋白的基因共转染，重组细胞表达的细 胞表面蛋白，可以采用荧光标记的抗体技术进行流式细胞技术分检。同样，荧光 性ＭＴＸ能与ＤｔｌＦＲ结合，ＤＨＦＲ也可以被ＦＡＣＳ技术分检。ＭＴＸ特异性荧光强度与重 组蛋白质的表达量相当。现在克隆细胞株可以通过自动化的仪器分检，如
养基中。ＨＥＫ２９３细胞系具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性，
２９３细胞已成为基凶转染实验巾最常使用的细胞系之一。以ＨＥＫ２９３为基础衍生 了一些新的ＩＩＥＫ细胞株，如ＥＢ病毒转化的ＨＥＫ．ＥＮＮＡ细胞，ＳＶ４０ Ｔ一抗原转化的
ＨＥＫ２９３
Ｔ株，Ｂ淋巴瘤细胞融合的ＨＫＢ—ｌ １细胞等，这些细胞株具有新的特性，
成为皋因转染实验中可供选择的新细胞株。
２．
重组表达载体
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基凶序列：大肠杆
菌复制予及抗生素抗性暴冈等，这样便于裁体侄原核细胞中扩增和大疑制备。另
外含有能使外源基凶在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终
止子和加ｐｏｌｙＡ信号序列。Ｔｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ｐｃＤＮＡ系列载体是实验中常用的
哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物研究进展
张玉彬吴梧桐
（中国药科大学生物化学教研究室南京２１０００９） 哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已成为当今生物制药领
域中的主流技术。目前大约有６０％以上的重组蛋一质药物的生产采用哺乳动物细
胞培养技术。哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高，它们１ｊ天然蛋白质具有相
有１５－２５％细胞在没有选择性压力的条件下稳定表达目的蛋白。染色体中的ＤＮＡ
元件会影响基因的沉默，如核骨架／基质结合区（Ｓ／ＭＡＲｓ）、绝缘体等染色体元 件将稳定重组细胞中蛋白质的表达。这些元件可以克隆到表达载体中，抑制异染 色体区的形成，减少基因的沉默。
３．
生物制备过程 哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大数是在生物反应器中进行
似的理化・忖质和乍物学功能。以默克、基凶泰克等围际大公刮为代表的大规模流
加培养生产工艺，其反应罐体积可以达剑１０吨以上，蛋白表达浓度为
１．０—２．Ｏｇ／Ｌ。我闻从２０００年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较晚，基础较 差，但经过努力实现了该项技术的突破。本课题组目ｆｉ＿ｉＪｉＦ．在开展哺乳动物细胞表 达重组蛋自和抗体药物的研究和技术开发。 １９８７年ＦＤＡ批准了基因泰克公刮生产的ｔＰＡ，这是世界上第一个哺乳动物细 胞制备的重组蛋一质药物，当时基因泰克公司借鉴了细菌大舰模培养技术，在搅 拌式反应罐中大规模培养悬浮重组ＣｌＩＯ细胞制备ｔＰＡ。这是一项具有晕程碑性的 工作，标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。
ＥｍｂｒｙｏｎｉＣ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３
ｃｅｌｌ）于１９７７年由Ｇｒａｈａｍ等
用５型腺病毒７５株系转化构建的，它含有ＡｄＳ Ｅ１区的人胚肾亚三倍体细胞系， 是一种Ｅ１区缺陷互补细胞系。２９３细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典
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型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ａｄ５和其他血清型腺病毒在其上增殖。贴 壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于２９３细胞的大规模培养。 ２９３细胞在无Ｃａ加或含Ｃａ２＋培养基中町同样生长，也可生长在血清浓度较低的培
在有一种趋势就是采用一次性设备或波动型搅拌反应器。细胞被培养于一次性塑 料装置中，体积可以达到５００Ｌ，这种装置的Ｋｌａ约为４／ｈ。目前也有供应商提供 一次性搅拌式反应罐，体积也可以达１吨位水平。
４．结束语
哺乳动物细胞培养生产重组蛋白质相关技术和设备的发展将会使该领域产 生革命性的变化。目前随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学研究，人们对哺乳 动物宿主细胞的生理、生化有了更深入的了解。通过增加细胞密度、延长培养时
备重组蛋白的研究。
１．
重组细胞系 哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，常用的细胞系有ＣＨＯ和１１ＥＫ２９３
两大类细胞。曾一度使用较多的ＣＯＳ细胞，由于强烈的贴壁作用，限制了大规模
悬浮细胞培养生产的实际应用。目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培
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养生产的研发中，如猿细胞衍生的Ｖｅｒｏ和ＣＶ－ｌ，以及人的胚胎干细胞等。 上世纪８０年代初期，Ｒｉｎｇｏｌｄ等首次报道采用非病毒性基因转移技术获得 了稳定性转染外源目的基因的哺乳动物细胞株，即永生化ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ
们多年来对哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处进行了深入研究与优 化，主要集中在对细胞株、表达载体、基因转移、重组细胞筛选、培养基的组成 以及生物过程等方面的改造和优化。特别是补料流加技术的采用，使细胞在长时 间的培养过程中细胞数目多、且健壮活泼。遗憾的是这些技术掌握在少数公司手 中，没有公开化。为了提高重组哺乳动物细胞表达重组蛋白质的产量，一般可以 从以下两个方面着手：改进基因传输和遗传筛选的方法，以加速高产细胞株的发 现，另一方面则是开发高效的细胞培养系统，以便快速、低成本地筛选生物制备 过程的优化条件，通过优化补料策略提高细胞密度和细胞的存活率。为了减少成 本和节约时问，近年来国外又开展了大规模哺乳动物细胞培养瞬时表达（ＴＧＥ）制