琼脂糖凝胶电泳

三、主要试剂
1、琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。 本实验配制 2％ Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5×TBE EB少许（终浓度0.5μg/ml）
2、电泳缓冲液： 常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。
本实验选用TBE，先配制5×TBE 贮存液： 54g Tris碱 27.5g 硼酸 调pH至8.2 20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) （或4.65g EDTA） 加dd H2O至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。
⑶ 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大 致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁 移率区别很小，难以分开。但采用适当浓 度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子 筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到 分离的目的。
⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范 围内是分子质量的函数，分子质量越大，移 动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对 于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相 对分子质量。
3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶
床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床 两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中， 并使样品孔位于电场负极。 5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越 过凝胶表面1～2mm为宜。 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现 有气泡，应设法去除。 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积 1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。
溴化乙锭用于核酸染色的优点：
⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml 的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。 也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这 一点。 ⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。
3、6×上样缓冲液： 4℃贮存 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30％ 甘油水溶液
4、10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液 在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力 搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室 温保存。
溴化乙锭（EB）染色原理：
溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以 嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激 发下，发出橙色荧光。这是因为： ①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm 的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； ②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收 302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面 的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可 见荧光。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支 持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别 是DNA的方法。 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一 种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要 用于分离较大片段的DNA分子（100bp～60kb）。
一、电泳基本原理
与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。 ⑴在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负 极移动； ⑵在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
五、注意事项：
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免 突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要 碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB 的溶液应做净化处理。
① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μg/ml，并轻轻混匀。
2、胶床准备：
①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
溴化乙锭缺点：
EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：①操作中务必带上防护用手套。 ②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。 ③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其 致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。
四、电泳操作步骤
1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA分子大小（kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 பைடு நூலகம்.2～4 0.1～3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V， 电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个 波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色 有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。