琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完 整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶的特点
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合 物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定 6.有热可逆性
（三）结 构 特 征
CM 甘油三脂 胆固醇 蛋白质 带电量（Q） pH8.6为例 颗粒大小（mm） 密度 电泳速度 形态 多 多 少 少 大 低 慢 规则 不规则 VLDL LDL HDL 少 少 多 多 小 高 快
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电 泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力 小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL 跑在前。
2. 按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.961.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL)
脂 蛋 白
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE
甘油三酯 （TG） 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 1. 按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白 （-位） 前-脂蛋白（2-位）） -脂蛋白 （1-位）
琼脂糖凝胶电泳步骤
琼脂糖凝胶电泳一、步骤：1、制胶(1%)：将加入30ml 1×TAE缓冲液和0.6g琼脂糖的三角瓶在微波炉加热至沸腾，摇匀至无颗粒。
2、倒胶：先插梳子，再倒胶。
胶冷却至60℃左右(不烫手)加染料后（胶-GelRed:1ml-1ul或30ml胶+3ulGelRed）缓缓倒入电泳槽(先胶布封口，放好梳子)，待胶凝固后取出梳子。
3、加样：1µl RNA + 2µl loading buffer混匀。
（点样孔置负极端即黑对黑，红对红）。
4、电泳：稳压条件下120V电泳，待溴酚蓝移动至接近胶前沿(约1cm)时停止电泳(约25min)。
5、观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显亮绿色荧光条带，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置，拍照。
二、注意事项：1、凝胶制备过程中，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
2、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
3、电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
4、如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。
5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。
在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具备网络结构，物质分子通过时会受阻力，大分子物质在汹涌时受的阻力小，因此在凝胶电泳中，磁铁颗粒的拆分不仅依赖于天量电荷的性质和数量，而且还依赖于分子大小，这就大大提高了辨别能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广为应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据ph不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的ph在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的dna片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离dna的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的dna片段。
dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时存有电荷效应和分子筛效应。
dna分子在低于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向负极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具备等量的净电荷，因此它们能够以同样的速率向负极方向移动。
2操作方式流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意dna酶污染的仪器可能会降解dna，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
(1)电泳方法1一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大dna链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的dna链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
(2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用以展开大片段核酸的电泳，高浓度的用以展开大片段分析。
低浓度胶坚硬，小心操作方式和采用质量不好的琼脂糖就是解决办法。
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。
一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。
二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。
一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。
F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。
此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。
当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。
根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。
该公式指球形颗粒所受的阻力。
代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。
带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。
在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。
它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。
影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳1. 什么是琼脂凝胶电泳？大家好，今天我们来聊聊一个科学小话题——琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。
听起来有点复杂，其实它就像是科学界的“选美比赛”，不过选的不是小姐姐，而是分子哦！这两个小家伙都是用于分离和分析生物分子的方法，主要在基因和蛋白质的研究中大显身手。
琼脂凝胶电泳是用琼脂凝胶来分离生物大分子，比如DNA、RNA和蛋白质；而琼脂糖凝胶电泳则是用琼脂糖，专门用于DNA的分析。
听起来是不是有点像“同门兄弟”的感觉呢？1.1 琼脂凝胶电泳的工作原理琼脂凝胶电泳的原理其实很简单。
想象一下，一条河流，河水流动，河里的石头和沙子各自沉浮。
琼脂凝胶就像这条河，而DNA分子就像在河里漂浮的小石头。
电流流过时，带电的分子在电场的作用下开始移动，移动的速度和距离就取决于它们的大小和形状。
小分子跑得快，大分子跑得慢，最终在凝胶里形成不同的位置，像极了学校运动会上那场激烈的接力赛。
1.2 琼脂糖凝胶电泳的应用而琼脂糖凝胶电泳主要是针对DNA的。
因为DNA分子比较大，所以我们需要用琼脂糖来制造凝胶。
这个过程可不简单，首先得把琼脂糖溶解，然后倒入模具里，等它凝固。
接着，咱们就可以把样品放进去，通电后就能观察到DNA分子的分离了。
这就像在举行一场大聚会，大家按身高、体重分组，最后排成一条长龙，看看谁的身形最抢眼！2. 准备工作与步骤当然，做电泳可不是随便搞搞就完事的。
咱们得先做好准备工作。
首先要准备好琼脂和琼脂糖，根据实验需求调配浓度，这就像做饭调味一样，浓度太高，分子跑不动；浓度太低，又不够清晰，真是个“难兄难弟”。
然后，得把样品和缓冲液混合，搅拌均匀，这一步就像调色板，颜色调和得越好，最后的效果才越惊艳！2.1 凝胶的制备接下来，咱们需要制作凝胶。
把琼脂和琼脂糖加热至完全溶解，然后迅速倒入模具，待其凝固。
这个过程就像等待美食出炉一样，既期待又有点小紧张。
凝固后，再在凝胶上打个小洞，放入样品，别忘了在样品的旁边加上分子量标准，这样最后才能评比，看看谁最出色。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种凝胶电泳方法，用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学，以分离琼脂糖基质中的大分子混合群，例如DNA、RNA 或蛋白质。
琼脂糖是从海藻中提取的天然线性聚合物，当在缓冲液中加热并冷却时，通过氢键形成凝胶基质。
它们是分离中、大型核酸最常用的介质，分离范围广。
琼脂糖凝胶电泳实验常用以DNA 切胶回收，DNA 分离和用于佐证DNA 是否重组、质粒等是否切开。
今天我们就来聊聊琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小细节。
第一步：胶液的制备称取0.4g 琼脂糖，置于200ml 锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热，直到琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。
总液体量不宜超过锥瓶的50%容量。
否则会溢出来的。
毛博就吃过这个亏。
还要擦洗微波炉。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
第二步：胶板的制备倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀。
东一块西一块的。
果冻做出来就不好看啦。
速度也不可太快，否则容易出现气泡。
果冻做出来里面都是气泡。
怎么吃呀？待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。
第三步：加样注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
果冻下面被戳个窟窿，还怎么吃呀？第四步：电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。
第五步：染色未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。
第六步：观察和拍照在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。
DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
除这些细节之外，还有一些注意事项：1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
琼脂糖凝胶电泳详解
一、简介琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质、利用核酸分子在电场中时的电荷效应和琼脂凝胶的分子筛效应，达到分离核酸混合物的一种电泳技术。
1、琼脂糖的分子筛效应1）琼脂糖（Agarose）来源于海洋红藻细胞壁，是一种大分子线性聚合物，基本结构是由D-半乳糖和3,6-anhydro-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成的双糖单位在α-1,3糖苷键的连接下形成的一个长链。
琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。
常用作电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到40℃左右形成良好的半固体状凝胶。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成直径从50nm-200nm不等的孔径结构，孔径的大小由凝胶浓度控制。
琼脂糖凝胶中孔径的大小，影响了通过的核酸分子的大小以及通过的速度。
通常来说，琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小，迁移速度也越慢。
DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA 片段越长，所需的胶浓度则越小。
选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。
2）琼脂的质量评价琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。
强度越高，凝胶性能越好。
质量较好的琼脂糖强度通常在1200g/cm2以上，硫酸根含量在0.2%以下，电内渗在0.13以下。
琼脂糖是从琼脂中分离而来的。
琼脂由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物，和琼脂糖结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。
在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质上，造成电内渗（EEO）。
电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。
琼脂糖凝胶电泳失败的原因
琼脂糖凝胶电泳失败的三大原因及解决方法琼脂糖凝胶电泳是常用分离DNA或RNA等生物大分子的方法之一。
但是，在进行琼脂糖凝胶电泳时，经常会出现失败的情况，影响实验
结果。
下面介绍三种常见的琼脂糖凝胶电泳失败原因及解决方法。
一、凝胶制备不当
凝胶制备不当是琼脂糖凝胶电泳失败的常见原因之一。
凝胶的浓
度和 pH 值的不准确，会导致样品在凝胶上的迁移速度不同，分离效
果差。
解决方法：
1、准确称量琼脂糖的用量，按标准比例配制凝胶；
2、保持 pH 值适当，通常为 7.5-8.0；
3、使用新鲜的试剂，防止污染。
二、电泳条件不正确
电泳条件对于琼脂糖凝胶电泳的成功与否有很大的影响，如果电
泳时间不够或者电场强度不够，样品可能没有分离开来。
解决方法：
1、选择正确的电泳缓冲液；
2、根据样品的大小和特性来制定合适的电泳时间和电场强度；
3、定期更换电泳缓冲液，防止污染。
三、样品制备不当
样品制备不良，也是琼脂糖凝胶电泳失败的原因之一。
不同的组织、细胞、DNA或RNA等样品，对样品的制备条件有不同的要求。
解决方法：
1、严格按照标准或常规操作制备样品；
2、根据样品的大小和性质，选择合适的溶解方法；
3、尽可能地去除污染物或者其他干扰物。
综上所述，准备好琼脂糖凝胶，选择合适的电泳条件，以及正确地制备样品，是避免琼脂糖凝胶电泳失败的关键。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂是一种多糖，主要由琼脂糖（约80%）和琼脂凝集素组成。
琼脂糖是一种中性物质，由半乳糖及其衍生物组成，不带电荷，而琼脂凝胶是一种含有硫酸盐和羧基的强酸性多糖。
因为这些基团是带电的，所以它们在电场的作用下能产生强烈的电渗作用。
此外，硫酸盐能与一些蛋清物质相互作用，影响电泳速度和分离效果。
因此，目前平板电泳常用琼脂糖作为电泳载体，其优点如下。
1.琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品无需预先处理即可电泳。
2.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
3.琼脂糖透明，无紫外线吸收。
电泳过程和结果可直接用紫外灯检测和定量测定。
4.电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
目前，琼脂糖常用作分离蛋白质和同工酶的电泳载体。
琼脂糖电泳和免疫化学的结合已经发展成为免疫电泳技术，它可以识别其他方法无法识别的复杂系统。
由于超微技术的建立，可以检测到0.1ug蛋白质。
琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如dna鉴定，dna限制性内切核酸酶图谱制作等。
由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
二、dna的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离核酸主要基于它们的相对分子质量和分子构型，并且与凝胶浓度密切相关。
1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系①dna分子的大小在凝胶中，dna片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当dna分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离dna时，分子大小不宜超过此值。
2.琼脂糖浓度如下表所示。
不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶分离。
琼脂糖凝胶电泳法
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
琼脂糖凝胶电泳法
1.琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
2.胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至45-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法，其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。
琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的，当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于核酸片段的电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法的可信度非常高。
琼脂糖凝胶电泳的原理荧光染料检测核酸的存在观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭(EB) 进行染色，所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团，当染料与核酸结合后呈现荧光。
核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。
注1：由于EB具有很强的毒性，因此在操作时一定要戴手套，并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。
注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的检测效果，同时毒性要低很多。
电泳区分核酸大小核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。
核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有重复性，长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
此外，含有琼脂糖的凝胶具有网状结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
实验三 琼脂糖凝胶电泳
三、实验材料
上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb）
关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时 所处的位置指示质粒的大小。
该质粒载体用的是pUC的复制子，拷 贝数能达到500-700个。
（三）电泳
打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动， 约一小时后即可观察。
（四）观察
将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯， 可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA
的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存； TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储
存，易产生沉淀；
分离大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。
常用6×凝胶加样缓冲液配方
有的10 × loading buffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限 制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为 例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一 条带没有什么区别（大概1000 bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有 电泳指示剂和沉淀样品的作用。
注意：同样的marker点在不同的胶孔中，电泳迁移率有差异。因为电泳 时有边缘效应，边上的跑得快；跑胶时间长了会发热，整快胶受热不均 时也会出现这种现象。
碱裂解法抽提质粒电泳会出现几条带？
但因为抽提质粒时各人的操作差异,造成CCC/OC/L等多种构型， 条带多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三条：超螺旋、 开环和复制中间体。 如果RNaseA添加过少或者质量不高，会导致RNA降解不完全， 会有一条远离点样孔跑的最快的残余RNA条带；根据RNA降解 程度不同，条带亮度会有很大差异。 提取过程中加溶液震荡剧烈会导致基因组片段断裂成很小的 片段，因此质粒中含有基因组的短片段会导致一些电泳条带 的出现。 还有电泳时间的长短造成各条带的移动距离也不一，一般较 难判断是对是错。电泳跑的时间较短，尽管能分出大小，但 习惯上跑开点对分辨差别不大的条带有好处，短胶容易出现 误判。
2%琼脂糖凝胶电泳
2%琼脂糖凝胶电泳
2%琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA分子的方法。
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖（agarose）制成的凝胶，可以形
成一个微孔网络结构，可以通过电泳的方式将DNA分子按大
小分离。
2%琼脂糖凝胶是指在制备琼脂糖凝胶时，琼脂糖的最终浓度
为2%。
通常，在制备琼脂糖凝胶时，将适量的琼脂糖溶解在
缓冲液中，加热溶解并冷却后形成凝胶。
在电泳过程中，将DNA样品混合溶于凝胶溶液中，再倒入凝
胶模具中进行凝胶固化。
然后在电泳缓冲液中通过直流电场，将DNA样品在凝胶中迁移。
由于琼脂糖凝胶的微孔结构，较
小的DNA片段会迁移得更快，而较大的DNA片段则迁移得
较慢。
最终，通过染色等方法可将DNA片段可视化，进而进
行分析和鉴定。
2%琼脂糖凝胶电泳在分离和检测DNA样品方面具有广泛的应用，例如DNA分析、基因测序、PCR产物分析等。
其操作简单、成本较低，因此被广泛应用于分子生物学研究、基因工程和医学诊断等领域。
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琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA分子大小（kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V， 电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个 波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色 有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。
3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶
床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床 两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中， 并使样品孔位于电场负极。 5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越 过凝胶表面1～2mm为宜。 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现 有气泡，应设法去除。 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积 1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。
8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
溴化乙锭缺点：
EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：①操作中务必带上防护用手套。 ②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。 ③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其 致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。
四、电泳操பைடு நூலகம்步骤
1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。
⑶ 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大 致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁 移率区别很小，难以分开。但采用适当浓 度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子 筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到 分离的目的。
⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范 围内是分子质量的函数，分子质量越大，移 动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对 于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相 对分子质量。
三、主要试剂
1、琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。 本实验配制 2％ Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5×TBE EB少许（终浓度0.5μg/ml）
2、电泳缓冲液： 常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。
本实验选用TBE，先配制5×TBE 贮存液： 54g Tris碱 27.5g 硼酸 调pH至8.2 20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) （或4.65g EDTA） 加dd H2O至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。
溴化乙锭用于核酸染色的优点：
⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml 的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。 也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这 一点。 ⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。
① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μg/ml，并轻轻混匀。
2、胶床准备：
①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支 持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别 是DNA的方法。 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一 种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要 用于分离较大片段的DNA分子（100bp～60kb）。
一、电泳基本原理
与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。 ⑴在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负 极移动； ⑵在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
五、注意事项：
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免 突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要 碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB 的溶液应做净化处理。
3、6×上样缓冲液： 4℃贮存 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30％ 甘油水溶液
4、10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液 在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力 搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室 温保存。
溴化乙锭（EB）染色原理：
溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以 嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激 发下，发出橙色荧光。这是因为： ①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm 的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； ②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收 302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面 的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可 见荧光。