霍乱弧菌的分离与鉴定
霍乱弧菌检测
可作为检材。
A
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（2）送检 剧烈腹泻病人的水样便含有大 量病菌，直接分离培养不难检出阳性。不
能立即检查的，要接种于培养基内，尽快 送往检验室。送检标本可放入（PH8.6-9.0） 碱性蛋白胨水，也可放入文—腊二氏保存 液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 中。
菌体尾端有鞭毛，运动极为活泼，在暗视野 显微镜下呈流星样运动，培养温度以37℃为 最适宜，在碱性（PH8.8～9.0）肉汤或蛋白 胨培养基上易于生长。
A
3
霍乱弧菌染色图片
革
鞭兰毛染 Nhomakorabea染
色
色
A
4
分群和分型：
根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成139个 血清群。
根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集 非O1群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。
的编码。 ▪ O139菌可以产生荚膜 ▪ 与O1群霍乱无交叉免疫力 ▪ 环境适应能力强 ▪ 耐药性强
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标本采集和送检
1、粪便采集
（1）采样 应在发病早期，服用抗菌药物之 前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采 集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新 鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛门 插入直肠内3cm-5cm处采取，水样便采取 1ml-3ml，成型便采取指甲大小的粪便量。
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鉴定
TCBS上出现黄色菌落，4号琼脂或庆大霉素 平板上出现灰褐色中心的菌落，均为可疑 菌落，应使用O1群和O139群霍乱弧菌的多 价和单价抗血清进行玻片凝集试验，结合 菌落特征和菌体形态，作出初步报告。
A
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疑似菌落鉴定基本要求：
霍乱弧菌检验程序
霍乱弧菌检验程序一、检查对象一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：1、弧菌形态：弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
传染病学指导：霍乱的实验室检查
霍乱常⽤的实验室检查有：
（1）直接镜检：
①直接涂⽚染⾊：将标本涂⽚，固定后⽤1∶10稀释⽯炭酸复红染⾊和⾰兰⽒染⾊，镜检有⽆典型弧菌。
典型霍乱弧菌互相连接平⾏排列，有如“鱼群”。
②悬滴标本：将标本制成悬滴，镜检细菌动⼒，⽤暗视野显微镜。
霍乱弧菌运动活泼，呈⼩鱼穿梭状。
（2）分离培养：将吐泻物直接或先经碱性胨⽔增菌后，接种于庆⼤霉素琼脂等培养基，容易检出霍乱弧菌。
应⽤荧光抗体检测粪便中霍乱弧菌，可于1～2⼩时内获得结果。
（3）⾎清学检查：可作⾎清凝集试验。
在发病第1～3⽇及第10～15⽇各取1份⾎清，若第2份⾎清的抗体效价⽐第1份增⾼4倍或4倍以上，有诊断参考价值。
（4）制动试验——快速诊断：在急性病⼈的⽔样便中含有⼤量弧菌，如悬滴检查阳性，再滴加不含防腐剂的霍乱多价⾎清（使⽤浓度为1∶64），⼏分钟内细菌运动停⽌，凝集成块即为阳性。
若具备下列条件之⼀者，可确诊为霍乱：
①凡有腹泻、呕吐等症状，⼤便培养霍乱弧菌阳性者；
②霍乱流⾏期间，在疫区有典型霍乱症状，⼤便培养阴性，⽽⽆其他原因可查者；
③有吐泻症状，霍乱弧菌培养阴性，作⾎清凝集试验第2份⾎清抗体效价呈4倍以上增⾼者。
在⾮疫区，凡有典型泻吐症状，在病原学检查未确定时，或在霍乱流⾏期间，曾接触过霍乱患者，有腹泻症状⽽⽆其他原因可查者，均应⾼度怀疑为霍乱，在给予积极处理的同时，应作⼤便培养，隔⽇1次，连续3次阴性者，才可以否定诊断，并作出疫情更正报告。
霍乱弧菌简述
霍乱肠毒素测定方法
• • • • • • 霍乱肠毒素测定主要以CTX为主 兔肠断结扎试验 中国地鼠卵巢细胞（CHO）试验 胶乳凝集试验 ELISA试验 分子生物学方法
初筛凝集和确认
• 玻片凝集试验 • 血清分型 • 试管凝集试验
小川 古典型 O1 群 稻叶 彦岛 小川 埃尔托型 稻叶 彦岛 非O1群 (O139) 非流行株
霍 乱 弧 菌
流行株
生化表型分析
• 糖发酵
对葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉等产酸不产 气； 迟缓发酵乳糖； 不发酵阿拉伯糖等；
Countries/areas reporting cholera and cases reported, by year, 1993–2003
1．霍乱肠毒素choleratoxin : A亚单位 ctxA B亚单位 ctxB 与受体介导A亚单位进入细胞
1A+5B
活性亚单位
致病机理
其他致病因子
பைடு நூலகம்
第七次 1961年 埃尔托生物型
• 霍乱弧菌形态
霍乱弧菌的分离和鉴定
• 对不同样品（水样、食品、水产品）前增菌 • 选择性平板分离（双洗琼脂平板、科玛嘉选 择性弧菌平板、碱性琼脂平板） • 疑似菌落初筛凝集和确认 • 生化表型分析 • 噬菌体-生物型分析 • 肠毒素分析(PCR) • 耐药表型分析（K-B) • 溯源或同源性分析(PFGE)
抗性
噬菌体-生物型分析
• • • • VP1-VP5噬菌体原液（108-109/ml） IV组噬菌体原液和常规稀释液（106/ml） 对溶原噬菌体敏感性的测定 溶原性测定
[医药卫生]霍乱弧菌实验室检验技术
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三、霍乱弧菌常规检验
样本采集、送检和保存 霍乱的病原学检查 病原分离技术要点
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样本采集、送检和保存
粪便：标本的采集以病人粪便为主，水样便采 取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦 可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～ 5cm处采取。急性期病人取水样便标本在增菌 培养的同时可取其粘液絮片或用棉拭子直接接 种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。带菌者粪 便都应接种碱性蛋白胨水培养基，放37℃增菌 6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物， 划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。不 能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或文腊二 氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养 基中。标本与保存液比例约为1∶5。
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两者不同点：
O139群所致病中有44.3%可发生腹部痉 挛，也有引起严重粘液性腹泻的，进入 外周血液可引起发热，出现菌血症或败 血症。印度出现20例病人中有17例发热、 白细胞增多。而O1群引起的病人未曾见 过。
鉴别两者，必须通过血清学诊断来区分。 O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必
– 不典型01群霍乱弧菌：可被多价01群血清所 凝集，但该群菌不产生肠毒素，因此无此病 性
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霍乱病原体分类
O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 稻叶型 颜岛型
霍乱弧菌
霍乱病原菌
O139群（Bengal） 非O1群
O2-O200群
腹泻病原菌
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O1群和O139群抗原构造与血清分型
须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
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总之，O139群霍乱弧菌和O1群弧菌二 者生物型既有区别又有联系。最大区别 是荚膜和O1群生物合成基因的有无这些 提示，O139群霍乱弧菌不是O1群EItor生 物型简单的点突变。可能存在更复杂的 突变机制。
霍乱弧菌实验室检测完整版
中、重型病例 。 临床诊断病例：符合下列任一类病例均为临床诊断病例。 临床表现为轻、中、重型或中毒型病例，并在腹泻病患者日常生活用品或家居环境中
检出O1群或/和O139群霍乱弧菌；
在一起确认的霍乱暴发疫情中，暴露人群中临床表现为轻、中、重型或中毒型病例。 实验室确诊病例： 临床病人并粪便、呕吐物或肛拭子细菌培养分离到O1群或/和O139群霍乱弧菌 ； 在疫源检索中，粪便培养检出O1群或O139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
挑可疑菌落、多价血清凝集
胶体金层析 卡检测
胶体金层析 卡检测
核酸提取 荧光PCR检测
血清分型、生化鉴定
问题：实验时间；灵敏度；初筛；等待时间
标本的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、操作台、砧板、下水道口……
要求：位置、数量
运输：
C-B运输培养基（pH8.4） 碱性蛋白胨水：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，不要用 运输培养基用前预冷1-2小时，采样后不能立即运至实验室时，需冷藏
特定地区？
感染因素多样化
初级感染因素、衍生的感染因素
确诊 病例 采样检测
就诊
患者
- 临床及时发现病例 - 细致的流行病学调查 - 实验室检测与分析 - 信息整合 - 控制行动
标本-粪便、呕吐物、水体、食品、、、
前处理：运输、调pH
增菌：碱性蛋白胨水（水体：加十倍浓缩液），6h – 过 夜
涂平板，16h ： 4号琼脂、TCBS、庆大霉素
S
SS S
S
73株弧菌的分离与鉴定
各种生化反应培养基，由桓台县卫生防疫检验所提供。霍乱弧菌诊断分型血清由兰州生物制品研究所提供。
三、分离鉴定程序 以无菌棉签取腹泻便分别置l％NaCl胨水和碱性胨水中，经37℃ 8—10h增菌，取表面培养物分别接种在4号琼脂甲
板和TCBS平板，经37℃18—24h培养后，挑取可疑菌落接种在KIA上。用霍乱弧菌多价诊断血清做玻片凝集试验。暗视野观察动力。做一
[4]李蓉，徐迪诚．微生物分类和鉴定技术进展．哈尔滨：光明日报出版社，1989： [5]李素波，毕平安，腹泻患者粪便弧菌属及气单胞菌属分离鉴定结果分析．佳木斯医学院学报，1995，18
表：
二、药敏试验结果 73株弧菌属细菌对10种抗菌药物中最敏感的是氯霉素(96.9％)，依次为复方新诺明(94.8％)，庆大霉素(87.4％)， 阿米卡星(66.8％)，妥布霉素(64.9％)，多粘菌素(59.5％)，四环素(56.6％)，环丙沙星(51.7％)。主要弧菌的耐药情况：副溶血弧菌的耐药 率是氨苄西林(94.8％)，青霉素G盐(91.8％)；致伤弧菌是氨苄西林(89.3％)，青霉素G盐(92.8％)；河弧菌是氨苄西林(85.7％)，青霉素G盐 (100.0％)；0—1群霍乱弧菌对氨苄西林耐药62.7％，对青霉素G盐和多粘菌素耐药率均为75．0％。
【文章编号】2095-1752（2014）21-0187-02
弧菌属(Vibrio)细菌是一群短小，弯曲呈弧状的的革兰氏阴性菌，是引起人类急性腹泻的主要病原菌之一。广泛分布于自然界，以水中
多见，本菌属大多菌种为非病原菌，对人致病的主要有霍乱弧菌和副溶血弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。近年来，由于水质污染和海产
讨论 与人类感染有关的弧菌属有12个种，感染后可引起不同程度的腹泻和食物中毒[3]。近年由弧菌属引起的感染性腹泻引起人们的关注。 微生物实验室也从监测沙门、志贺菌属为主，向弧菌属转移。为加强霍乱弧菌的监测，2007-2011年我们对来院就诊的腹泻病人全部进行了 弧菌属的培养鉴定。同期检出弧菌属细菌73例，分离率为11.1％，而检出的沙门、志贺菌属只有21例，分离仅为3.1％，说明弧菌属细菌已 成为桓台地区感染性腹泻的主要病原菌。 弧菌属增菌液以1％NaCl胨水和碱性胨水为好，方便，适用，且效果满意，选择培养基则以TCES为佳[4]。本文分离出的4株o—1群霍 乱弧菌经血清学鉴定均为小川型。患者呈散在发病。由于隔离治疗及时，经住院后均痊愈，末造成流行，因而微生物实验室在夏秋二季加 强对霍乱弧菌的监测工作是防止霍乱流行的重要措施[5]。 必须贯彻预防为主的方针，加强检疫，及时检出病人，严格隔离治疗，必要时实行疫区封锁，以免疫情扩大蔓延。接种霍乱死菌苗， 能增加人群的免疫力，保护率为55%-90%,免疫力维持的时间较短，一般为3-6个月。口服减毒活菌苗和注射类毒素可自动免疫，特别是自 然筛选或通过基因重组技术获得只产生B亚单位的活菌苗，可诱导产生有效的抗毒性和抗菌性免疫。同时，及时和适当补充液体和电解质是 治愈霍乱的关键所在。常用的抗菌药物有四环素，强力毒素。近年来用氟哌酸，氟嗪酸撩闲亦佳。 参考文献 [1]庞敏，山东省淄博市桓台县结核病防治所检验科 [2]毕平安，李素波．浙江嘉兴地区感染性腹泻患者病原菌调查。中华流行病学杂志，1994，15(6A)；117 [3]娄永新，王金良．实用临床细菌学检验与进展．天津：天津科技翻译出版公司，1993：145
霍乱弧菌的分离与鉴定.总结
霍乱弧菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心一、标本的采集和送检:1.标本的采集：1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集；2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。
3)采样要求：☞水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。
☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。
☞按1:10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
4）肛拭采集的注意事项：1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断；2.棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落)；3.采集者应穿戴一次性手套；4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出；5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm(幼儿约2～3cm)处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出；6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少；7.采集的标本拭子应立即置入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。
填写采样登记表(单)，并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。
二、快速诊断：1.直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(最好用暗视野)，可见具有流星状动力的细菌。
2.特异性制动试验：☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异，操作简便，可☞在几分钟之内做出初步诊断。
霍乱弧菌显色培养基使用说明
在增菌液中用接种环取一环，于霍乱弧菌显色平板上划线分离，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
5、通过验证试验进一步确认假定性霍乱弧菌，如氧化酶、革兰氏染色等。
结果判断
菌落色泽 初筛微生物
绿~蓝绿色的菌落 霍乱弧菌
无色菌落 其它
注：最后的鉴定须做补充试验。
外观：
脱水培养基：浅黄色具流动性粉未。
制备好平板：淡黄色的胶。
储存条件和保质期：
脱水培养基：10-30℃，保质期二年。
制备好平板： 2-8℃，最多保存两周。
2、以无菌操作取检样25 g(mL)，加入碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min，或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌容器内，加225 mL碱性蛋白胨水，并充分振荡。
3、增菌：将上述1:10稀释液于36 ℃±1 ℃培养6h～8h，如有需要可进行二次增菌。
霍乱弧菌显色培养基使用说明
用 途：
用于水产品及食物中毒样品中霍乱弧菌的分离和鉴定。
Hale Waihona Puke 组分由琼脂、蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、色素等组成。PH：9.2 ± 0.1
显色图片
使用方法
1、取瓶内干粉5.1克，用1L蒸馏水或纯水溶解，可按比例扩增或缩小。搅拌加热煮沸至完全溶解，不需高压灭菌，冷至约50℃，倾注灭菌平皿。
霍乱弧菌的分离与鉴定
明胶素
+++++++- - - - -
在不同盐量胨水中生长试验
0% NaCl
++------ - - - -
3% NaCl
++++++++ + + + +
6% NaCl
+/- +/- + +/- + +/- + + +/- + + +
8% NaCl
- - + - + - +/- - - +/- - -
透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或稍凸起、边缘整齐，菌落直径一般约为 2 毫米。 3.4.2 庆大霉素琼脂和四号琼脂：菌落特征与碱性营养琼脂上生长的菌落相似， 但透明性略差，多呈半透明状，由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份，菌落中央 常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。 3.4.3 TCBS 琼脂：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。
L-赖氨酸
+ + + + + - - +/- - -/+ + +
L-鸟氨酸
+ + + +/- +/- - - - - - - -
L-精氨酸
- - - - - + + + - +/- - -
葡萄糖产气
- - - - - - + -/+ - - - -
乳糖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
霍乱弧菌的分离与鉴定
要注意同一标本存在 O1 群和 O139 群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每 份标本至少挑选 5 个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。 4.1.2 氧化酶试验
试剂：1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。 试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上， 然后滴加上述试剂，如培养物在 lmin～2min 内出现粉红—紫红—紫蓝色，有的 最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。 4.2 菌株复核 经初筛阳性或可疑阳性的菌株，在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地 疾病预防控制中心（CDC）进行复核鉴定。复核结果符合 O1 群或 O139 群霍乱弧 菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将 菌株上送省级或以上 CDC（参比实验室）进行确认分析。菌株的复核鉴定应以纯 培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰氏染色、 粘丝试验、氧化酶试验、动力试验。对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应 不典型的菌株应增做试管凝集试验。
10% NaCl
- - - - +/- - - - - - - -
O/129 敏感性
10μg
S① S R S R R R S R S R
150μg
S① S S S S S S S S S S S
①部分 O139 群霍乱弧菌为抗性（R）。
霍乱弧菌系统生化鉴定详见表 1。
表 1 部分弧菌科细菌的系统生化鉴定
霍拟副创溶河弗海 霍 麦 辛 鲨
项
乱态溶伤藻弧尼鱼 利 氏 辛 鱼
弧弧血弧弧菌斯弧 斯 弧 那 弧
目
菌菌弧菌菌
弧菌 弧 菌 提 菌
菌
菌
菌
弧
菌
野生水鸟感染霍乱弧菌和沙门菌等病原菌的分离和鉴定
野生水鸟感染霍乱弧菌和沙门菌等病原菌的分离和鉴定祝令伟;郭学军;景洁;梁冰;王莹;田园;纪雪;孙洋;初冬;高玉伟【摘要】目的从死亡的野生水鸟标本中分离、鉴定病原菌,评估迁徙鸟类传播人兽共患病原菌的风险.方法采集的组织标本涂布营养琼脂平板,分别在需氧和厌氧的条件下培养.分离的菌株使用Phoenix100全自动微生物鉴定仪和16srRNA测序的方法鉴定细菌种属,随后通过PCR的方法检测病原菌携带主要毒力基因的情况.结果从骨顶鸡、鸬鹚和红嘴鸥等鸟类的组织标本中分离鉴定出霍乱弧菌、沙门菌和产气荚膜梭菌等多种肠道感染相关的病原细菌.霍乱弧菌经PCR鉴定不属于O1和O139血清群,无霍乱毒素和毒素相关菌毛的编码基因,但是有溶血素的编码基因.结论检测的死亡鸟类个体存在多病原细菌的感染.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】5页(P212-215,222)【关键词】野生鸟类;霍乱弧菌;沙门菌;风险评估【作者】祝令伟;郭学军;景洁;梁冰;王莹;田园;纪雪;孙洋;初冬;高玉伟【作者单位】军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春130122;国家林业和草原局森防总站,沈阳 110000;军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春 130122【正文语种】中文【中图分类】R378野生动物被认为是“病原的天然储存库”，许多烈性的人类传染病如SARS和埃博拉等，其感染和传播的源头都指向野生动物。
霍乱弧菌的分离与鉴定、霍乱诊断的相关实验技术、鉴别诊断.pptx
菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、血清分型、 动力试验、CT毒素基因检测（按附录B）,也可选择生化鉴定条或全自动微生物生化鉴定系统。凝集反应不典型或者 怀疑为彦岛型的菌株应增做试管凝集试验。菌株血清群的鉴定也可用聚合酹链式反应（PCR）方法扩增01群和0139 血清群脂多糖特异性基因力来确定（按附录B）。
C.2.1肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）性肠炎
潜伏期4h〜24h,有发热、恶心呕吐及腹部绞痛，腹泻呈黄水或清水样便，无脓血便,严重腹泻者亦可产生重度脱 水，婴幼患儿常因此而危及生命。
C.2.2肠致病性大肠埃希菌（EPEC）性肠炎
主要症状为腹泻，大便为黄色和黄绿色蛋花样稀水便，量较多，常有特殊腥臭味，重症者可有脱水等全身症状 。
A.2标本的送检
采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入pH8.4〜9.2的碱性蛋白陈水或文腊二氏保存液或插 入Cary-Blail•半固体保存培养基中，放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例 约为1:10,肛拭子应插入5m1.运送培养基或增菌液中。
A.3分离培养
诺如病毒感染在各年龄人群普遍易感，可引起暴发流行，是成人病毒性腹泻的首位病原体。临床症状主要以腹 泻和呕吐为主，水样便或稀便多见，可伴有腹痛、恶心、纳差、乏力、低至中度发热等。粪便标本诺如病毒检测阳 性。
C.6急性细菌性痢疾
由志贺菌引起，潜伏期Id〜2d,起病急，以发热、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便为主要特征，有全身感染中毒 症状。重症患者可伴有头痛、全身肌肉酸痛甚至惊厥，可出现脱水和电解质紊乱相关症状。不典型的急性细菌性痢 疾以婴儿多见，多无全身中毒症状、不发热或低热，腹痛较轻，粪便呈水样或稀糊样，含少量黏液，左下腹可有压 痛，应注意鉴别。急性中毒性细菌性痢疾可出现高热，在儿童患者早期即可出现烦躁、谐妄、惊厥等，发病初期肠 道症状不明显。成人患者主要表现为黏液脓血便频繁，呈里急后重。从粪便或肛拭标本等检出志贺菌可确诊。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
霍乱弧菌的选择分离及培养
牛肉膏粉 3g
氯化钠 5g
蔗糖10g
柠檬酸钠10g
无水亚硫酸钠3g
庆大霉素500U
琼脂15g
最终pH8.5±0.2
使用方法：
1、称取本培养基56g，加入蒸馏水或去离子水1 L，加热煮沸充分溶解，冷至50℃左右，每500mL培养基加入配套试剂1支 (SR0190)( 2.5mg亚碲酸钾)，摇匀，立即倾注平皿，待凝固后，备用。
2、取待微生物检测菌的新鲜纯培养物划线接种于琼脂平板上，于36±1℃培养20—24h。
质量控制：
下列菌株接种后于36±1℃培养20—24h，结果如下：
菌 名 菌 号 生长状况 菌落特征
霍乱弧菌 V60 好 淡灰色
大肠埃希氏菌 ATCC25922 被抑制 ——
贮 存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。
霍乱弧菌霍乱弧菌检测霍乱弧菌肠毒素副溶血弧菌鸡弧菌性肝炎霍乱弧菌致病副溶血性弧菌鳗弧菌河弧菌副溶血性弧菌检验
品种名称：庆大霉素琼脂
编号：025050
用 途：用于霍乱弧菌的选择性分离培养。
形态与特性：
古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型，为革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。
图册：
原 理：
蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子;氯化钠维持均衡的渗透压;蔗糖提供碳源;亚硫酸钠可刺激弧菌生长;柠檬酸钠、庆大霉素和亚碲酸钾及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性杂菌;霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长;琼脂是培养基的凝固剂。
台湾泥鳅腐皮病霍乱弧菌的分离与鉴定
台湾泥鳅腐皮病霍乱弧菌的分离与鉴定杨宁;姜芳燕;陈攀;马军;陈燕;曹柳;侯兴蓉【期刊名称】《海南热带海洋学院学报》【年(卷),期】2024(31)2【摘要】为研究台湾泥鳅(Paramisgumus dabryanus ssp.)腐皮病的病原,对其腐皮等病变部位进行细菌分离纯化,获得1株优势菌株,命名为P1,利用革兰氏染色观察其形态特征,利用PCR扩增技术、16S rRNA基因测序,得到病原菌的序列,用MEGA软件构建系统进化树,再结合生理生化分析结果鉴定菌种名称。
结果发现:革兰氏染色阴性,弧形,两端钝圆;菌体长1~1.5μm,宽度1~1.2μm,有菌丝和鞭毛,16S rRNA基因1 395 bp。
建立系统进化树后发现,P1与霍乱弧菌处于同一分支;生理生化实验结果与霍乱弧菌一致,从而鉴定该菌株为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。
药敏实验结果表明,该分离菌株对头孢哌酮、卡那霉菌、万古霉素等10种抗生素高度敏感;对四环素中度敏感;对呋喃唑酮、复方新诺明、克林霉素等17种抗生素耐药。
实验结果为台湾泥鳅腐皮病的病原鉴定与药物防治提供参考。
【总页数】7页(P18-24)【作者】杨宁;姜芳燕;陈攀;马军;陈燕;曹柳;侯兴蓉【作者单位】海南热带海洋学院热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室;海南热带海洋学院海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室;海南热带海洋学院海南热带海洋学院崖州湾创新研究院;琼台师范学院热带生物多样性与资源利用实验室【正文语种】中文【中图分类】S942.9【相关文献】1.泥鳅源霍乱弧菌的分离鉴定及药敏试验2.台湾泥鳅幼鱼红点病病原的分离鉴定及药敏分析3.大鳞副泥鳅腐皮病病原菌及其拮抗菌的分离筛选4.棘胸蛙腐皮病病原菌分离鉴定及五倍子水提液的治疗效果探究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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霍乱弧菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心一、标本的采集和送检:1.标本的采集：1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集；2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。
3)采样要求：☞水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。
☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。
☞按1:10比例臵入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
4）肛拭采集的注意事项：1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断；2.棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落)；3.采集者应穿戴一次性手套；4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出；5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm(幼儿约2～3cm)处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出；6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少；7.采集的标本拭子应立即臵入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。
填写采样登记表(单)，并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。
二、快速诊断：1.直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(最好用暗视野)，可见具有流星状动力的细菌。
2.特异性制动试验：☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，臵于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异，操作简便，可☞在几分钟之内做出初步诊断。
但要求标本必须有较多数量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐剂的。
3.早期玻片凝集试验：☞埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37℃培养8～10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的情况下，埃尔托型菌落直径可达1～2mm。
将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可做初步报告。
琼脂平皿继续培养，接常规培养时间再作一次复查。
4.霍乱弧菌胶体金免疫层析快速检测：(1)原理：采用胶体金免疫层析双抗体夹心法，检测标本中霍乱弧菌。
以胶体金作为标记物，交联抗霍乱弧菌(O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻叶血清型)单克隆抗体，与样品中的霍乱弧菌(O1群/O139群)结合。
形成双抗体夹心一步法，呈现出目测可见的红色条带，显色程度与抗原含量成正比。
(2)特点：☞灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，省力省时；☞对于典型霍乱病人水样或米泔样便结果准确、易于判读；☞但对于含霍乱弧菌少的粪便标本易出现假阴性；☞对脓血便标本易出现假阳性。
3)操作步骤：☞将检测卡放臵与洁净、干燥的工作台上；☞实验前，请将试剂恢复至室温；☞用吸管取病人水样便样品2～3滴，加入检测卡一端的加样孔，计时并观察反应结果；☞2-15分钟内观察结果，20分钟之后结果不能判读。
(1) 滤样纸（加样区）；(2) 玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗原；(3) 硝酸纤维素膜，膜上包被的抗原和抗体呈线状；(4) 吸水纸。
三、直接分离、培养：☞急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可用选择性培养基直接划线分离。
目前常用的强选择性培养基有TCBS琼脂、4号琼脂和庆大霉素琼脂等。
☞臵37℃10～14h孵育培养。
四、APW增菌、分离：☞所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人，带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出，需经碱胨水37℃增菌6～8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；☞标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1～0.2毫升，接种于8～10毫升的碱胨水中，37℃培养6～8小时后再做分离；☞霍乱弧菌好氧，易形成的菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10～14h孵育培养。
五、血清学凝集试验：1.玻片凝集试验：☞自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱多价诊断血清、O139群霍乱诊断血清以及稻叶、小川型诊断血清做玻片凝集试验；☞同时注意做盐水凝集对照试验。
2.要求及注意事项:☞有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;☞必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集(对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意)。
☞平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;☞从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌；☞注意当霍乱弧菌在4号及庆大霉素培养基上生长过久(超过36小时)时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象；☞故应取新鲜培养物(10～14h)作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
☞小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故；☞首例病人应以两个单价血清的试管凝集试验确定。
六、初步鉴定试验：1.氧化酶试验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。
或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红－紫红－紫蓝色（有的最后呈黑紫色）为氧化酶阳性。
（肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性）。
氧化酶试验注意事项：试验时避开含铁物质（如接种环）。
不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培基及含亚碲酸盐培基上的菌落(亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶)，以免出现假阳性和假阴性。
2.拉丝试验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。
阳性者很快(30S内)由混变清并变得很粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。
阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。
（古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。
）弧菌科菌属氧化酶试验、拉丝试验鉴别表3.O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：☞用接种环或灭菌棉拭子在含0.5％氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10µg、150µgO/129磷酸盐药敏纸片各一片，37℃培养过夜。
凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。
☞古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感；☞O139群霍乱弧菌10µg、150µg均不敏感。
七、初步结果报告：霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出判定。
凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群并可用单价血清分型即可判定。
首例病人应辅以氧化酶、拉丝试验、O/129敏感试验。
基层CDC 至此即可上报。
上报国家需做生化、噬菌体-生物分型试验。
报告名称－－“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。
八、生化鉴定试验：九、噬菌体-生物分型：1. 古典型和Eltor分型：☞目前仍依靠第IV组霍乱噬菌体常规稀释液(106/毫升)裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集、V-P和溶血试验进行两种生物型的鉴别仅作参考。
埃尔托型已出现大量非溶血菌株，因此溶血试验已不能作为区别两个生物型的主要方法。
O1群霍乱弧菌古典型和El-Tor生物型的鉴别(1)噬菌体分型：☞根据五株国内分离的5种弧菌噬菌体 (VP1～VP5)将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型 (见下表)。
方法：利用双层琼脂平皿法进行噬菌体滴皿裂解试验。
(2)生物分型：☞根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托弧菌分成12个生物型。
埃尔托霍乱生物分型表埃尔托霍乱弧菌噬菌体-生物分型表十、O1群与O139群霍乱弧菌的鉴别：十一、霍乱菌种的登记、保存、上送和管理:1.霍乱菌株的登记：基层实验室所检获的阳性菌种及可疑菌种，均应作好菌株来源详细情况的登记工作,包括编号、被检人或物名称、菌株来源(病人、带菌者或外环境)、分离地点(地址)及初步鉴定结果(见省CDC “河南省霍乱监测方案”附表),一式两份,一份自己保存,一份随菌种上送。
2.霍乱种株的保存：对初步鉴定的霍乱弧菌及可疑菌株(包括不凝集弧菌)，均应接种半固体菌种管培养基，经37℃过夜培养，用胶塞或石蜡封口，室温保存，切勿放入冰箱，因霍乱菌种半固体的最佳保存环境是18～25℃(一般可存活4～5年)。
☠霍乱弧菌在4 ℃～8℃以下极易死亡。
3.霍乱种株的上送：菌、毒种的上送工作是程序，也是制度。
按照《中华人民共和国传染病防治法》、卫生部规定：各疫点市(县)在本年度疫情结束后必须立即收集整理当地分离到的所有霍乱菌株和可疑菌株，认真登记、造册，连同菌种一并派专人(2人)护送上级市(地)CDC；市(地)防疫站收集、整理所辖市、县上送菌种后，再届时按毒菌种管理规定上送省CDC，最后由省CDC统一进行编号、登记、整理备案，并进行血清学、生化学及噬菌体-生物分型鉴定、药物敏感性测定后上报国家CDC和卫生部。
4.霍乱种株的管理：相关法规：《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和卫生部菌种管理委员会制定的《中国医学微生物菌种保藏管理办法》。
菌（毒）种的保藏由国务院卫生行政部门指定的单位负责。
一、二类菌(毒)种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌(毒)种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
认真做好登记，统一编号，冻干保存，按期传代、鉴定，并作好有关检验记录。
在保存过程中发生菌、毒种变异或死亡，应及时上报科主任及主管部门。
当地所检出的地方菌、毒株应及时上报，因工作需要暂时保留的菌、毒株也应按上级规定的时间进行销毁处理。
新发现的菌、毒种，要做好原始记录，一并上报主管部门复核确认。
使用一类菌(毒)种的单位，必须经国务院卫生行政部门批准；使用二类菌(毒)种的单位必须经省级政府卫生行政部门批准；使用三类菌(毒)种的单位，应当经县级政府卫生行政部门批准。
一、二类菌(毒)种，应派专人向供应单位领取，不得邮寄；三类菌(毒)种的邮寄必须持有邮寄单位的证明，并按照菌(毒)种邮寄与包装的有关规定办理。
未经上级主管部门批准，任何单位及个人不得以工作之便，进行国际间各类菌、毒种交流。