霍乱弧菌的分离与鉴定

霍乱弧菌的分离与鉴定

濮阳市疾病预防控制中心

一、标本的采集和送检:

1.标本的采集：

1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集；

2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉

拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。

3)采样要求：

☞水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。

☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。

☞按1:10比例臵入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。4）肛拭采集的注意事项：

1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断；

2.棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落)；

3.采集者应穿戴一次性手套；

4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出；

5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用

单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm(幼儿约2～3cm)处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出；

6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少；

7.采集的标本拭子应立即臵入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。填写采样登记表(单)，并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。

二、快速诊断：

1.直接镜检：

为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(最好用暗视野)，可见具有流星状动力的细菌。

2.特异性制动试验：

☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，臵于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微

镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优

点是快速而特异，操作简便，可

☞在几分钟之内做出初步诊断。但要求标本必须有较多数量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐剂的。

3.早期玻片凝集试验：

☞埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37℃

培养8～10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的情况下，埃尔托型菌落直径可达1～2mm。将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可做初步报告。琼脂平皿继续培养，接常规培养时间再作一次复查。

4.霍乱弧菌胶体金免疫层析快速检测：

(1)原理：采用胶体金免疫层析双抗体夹心法，检测标本中霍乱弧菌。以胶体金作为标记物，交联抗霍乱弧菌(O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻叶血清型)单克隆抗体，与样品中的霍乱弧菌(O1群/O139群)结合。形成双抗体夹心一步法，呈现出目测可见的红色条带，显色程度与抗原含量成正比。

(2)特点：

☞灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，省力省时；

☞对于典型霍乱病人水样或米泔样便结果准确、易于判读；

☞但对于含霍乱弧菌少的粪便标本易出现假阴性；

☞对脓血便标本易出现假阳性。

3)操作步骤：

☞将检测卡放臵与洁净、干燥的工作台上；

☞实验前，请将试剂恢复至室温；

☞用吸管取病人水样便样品2～3滴，加入检测

卡一端的加样孔，计时并观察反应结果；

☞2-15分钟内观察结果，20分钟之后结果不能

判读。

(1) 滤样纸（加样区）；

(2) 玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗原；

(3) 硝酸纤维素膜，膜上包被的抗原和抗体呈线状；

(4) 吸水纸。

三、直接分离、培养：

☞急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可用选择性培养基直接划线分离。目前常用的强选择性培养基有TCBS琼脂、4号琼脂和庆大霉素琼

脂等。

☞臵37℃10～14h孵育培养。

四、APW增菌、分离：

☞所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人，带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出，需经碱胨水37℃增菌6～8小时后分离(夏日可将运送时间计算在

内)；

☞标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1～0.2毫升，接种于8～10毫升

的碱胨水中，37℃培养6～8小时后再做分离；

☞霍乱弧菌好氧，易形成的菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板

37℃10～14h孵育培养。

五、血清学凝集试验：

1.玻片凝集试验：

☞自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱多价诊断血清、O139群霍乱诊断血清以及稻叶、小川型诊断血清做玻片凝集试验；

☞同时注意做盐水凝集对照试验。

2.要求及注意事项:

☞有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;

☞必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集(对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意)。

☞平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;

☞从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌；

☞注意当霍乱弧菌在4号及庆大霉素培养基上生长过久(超过36