[课件]植物原生质体的分离与纯化PPT
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植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
原生质体培养PPT课件
生质体易受热伤害，易破碎。
5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X
射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质
体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物 原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。
原 生 质 体 培 养 程 序 示 意 图
原生质体5次。
（6）在载玻片上的材料上，加上一层原生质体生
长所须的培养基
（7）融合百分率计算 融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数 ×100%
完整洋葱原生质体（40×） 完整烟草原生质体 （40×）
PEG PEG法原生质体的融合图示 法原生质体的融合图示
图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 细胞原生质体融合（40×） 细胞原生质体融合（40×）
三、原生质体存活率、密度及产量的测定
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100 （二）测定原生质体的密度
原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
（三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW
Y（个/g）——原生质体产量
D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×）
原生质体融合（图1）
电融合法原生质体的融合结果
原生质体融合（图2） 原生质体融合（图3）
三、杂种细胞的筛选与鉴定 （一）互补筛选 1、白化互补选择法
2、营养缺陷型互补选择
3、抗性互补选择
4、代谢互补仰制选择
（二）机械分离杂种细胞法法 （三）双荧光标记选择法
植物原生质体组织培养PPT课件
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
第3页/共83页
Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
第23页/共83页
影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
第6页/共83页
原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
第7页/共83页
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
第4页/共83页
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第5页/共83页
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离试验方法ppt课件
Here, we report a simplified method for isolating protoplasts from normally cultivated young rice green tissue without the need for unnecessary chemicals and a vacuum device.
绿色植物原生质体成功用于植物与激素、代谢物及环境因素相关的信 号转导的研究。
简化并提高了基因短暂表达的系统，并结合蛋白质免疫印染、点位及 蛋白质-蛋白质相关试验。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
主要内容
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
研究结果
Importantly, the rice green tissue protoplasts were photosynthetically active and sensitive to the retrograde plastid signaling inducer norflurazon (NF). Transient expression of the GFP-tagged light-related transcription factor OsGLK1 markedly upregulated transcript levels of the endogeneous photosynthetic genes OsLhcb1, OsLhcp, GADPH and RbcS, which were reduced to some extent by NF treatment in the rice green tissue protoplasts.
绿色植物原生质体成功用于植物与激素、代谢物及环境因素相关的信 号转导的研究。
简化并提高了基因短暂表达的系统，并结合蛋白质免疫印染、点位及 蛋白质-蛋白质相关试验。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
主要内容
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
研究结果
Importantly, the rice green tissue protoplasts were photosynthetically active and sensitive to the retrograde plastid signaling inducer norflurazon (NF). Transient expression of the GFP-tagged light-related transcription factor OsGLK1 markedly upregulated transcript levels of the endogeneous photosynthetic genes OsLhcb1, OsLhcp, GADPH and RbcS, which were reduced to some extent by NF treatment in the rice green tissue protoplasts.
原生质体的分离与纯化
实验材料： 实验材料：
菠菜、油菜等。பைடு நூலகம்菠菜、油菜等。
实验用品： 实验用品：
用具：显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、 用具：显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、尼 龙过滤网、离心管、剪刀、镊子、吸水纸等。 龙过滤网、离心管、剪刀、镊子、吸水纸等。 药品：70%乙醇 、甘露醇 、CPW缓冲液 、纤维素 缓冲液、 药品：70%乙醇、甘露醇、CPW缓冲液 果胶酶、20%蔗糖溶液等。 酶、果胶酶、20%蔗糖溶液等。
实验步骤： 实验步骤：
1 选取叶片：选取充分伸展的幼嫩叶片，自来 选取叶片：选取充分伸展的幼嫩叶片， 水清洗后，用吸水纸吸干水分。 水清洗后，用吸水纸吸干水分。
2 撕下表皮：用钟表镊子将叶子的下表皮撕掉， 撕下表皮：用钟表镊子将叶子的下表皮撕掉， 注意不要损伤叶肉细胞。 注意不要损伤叶肉细胞。 3 酶解：在培养皿中放入混合酶液，将去掉下 酶解：在培养皿中放入混合酶液， 表皮的叶片剪成小块，去下表皮面向下铺于酶液中， 表皮的叶片剪成小块，去下表皮面向下铺于酶液中， 充分接触酶液。25~30 30℃ 酶解2 3小时。 充分接触酶液。25 30℃，酶解2~3小时。 4 过滤：酶解后的混合物用双层漏斗进行过滤， 过滤：酶解后的混合物用双层漏斗进行过滤， 只允许单细胞和原生质体通过。 只允许单细胞和原生质体通过。 5 纯化 ： 用比原生质体比重大的 20% 蔗糖溶液 ， 纯化： 用比原生质体比重大的20 蔗糖溶液， 20% 离心后原生质体漂浮在溶液的表面。 离心后原生质体漂浮在溶液的表面。
结果与讨论： 结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 预期结果： 颜色鲜艳，富含细胞质。 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
2 讨论： 讨论： 选择合适的材料是实验成功的首要因素， ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素 ， 请问该实验选材时注意什么问题？ 请问该实验选材时注意什么问题？ 酶解时酶液的组成及浓度如何确定？ ② 酶解时酶液的组成及浓度如何确定？ 研究原生质体的意义是什么？ ③ 研究原生质体的意义是什么？
五 植物原生质体的分离与纯化
实验五 植物原生质体的分离与纯化 2017.10.266. 实验结果与分析6.1实验结果图1.光学显微镜下菠菜原生质体观察（物镜×40倍） H ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：细胞壁Q ：梯细胞 W ：原生质体碎片结果描述：光学显微镜下，完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的绿色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，绿色；视野中还有一些绿色的原生质体碎片；被分离的细胞壁为透明的圆形；梯细胞为透明螺旋状，形似梯子。
原生质体纯度：完整原生质体/总原生质体=27/65=41.5％① ② ③ ④ HP Q H K W结果分析：光学显微镜下原生质体为颗粒状的绿色不均匀分布是由于光学显微镜下看到的是原生质体的叶绿体，所以为颗粒状分布，又因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深；因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。
由于在制作悬浮液或离心时会对原生质体造成冲击，所以会有一些原生质体破碎。
梯细胞最终发育为维管。
原生质体的纯度为41.5％，相对来说结果还算理想，因为去除细胞壁的原生质体较为脆弱，很容易受到破坏。
W ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：木质素Q ：原生质体碎片结果描述：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的红色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，红色；视野中还有一些红色的原生质体碎片和呈黄色的木质素。
结果分析：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为红色，主要是因为在荧光下叶绿体泛红光，主要通过观察叶绿体来辨别原生质体的具体形态。
因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深，又因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。
视野中呈透明黄色的为木质素，为细胞壁的成分。
植物原生质体培养ppt课件
界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无 损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片 等杂质沉于管底。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
植物的原生质体培养PPT课件
其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
第九章生物物质分离与纯化 ppt课件
SDS PAGE of Purification
10 micrograms loaded in each lane
六、最后加工 包括结晶和枯燥
Industrial Scale up
To transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting.
经过参与一些中性盐，导致胶体出现凝聚的不稳定的景 象。表征电解质凝聚才干的大小用凝聚价，即使胶粒 发 生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高 该值就越小，凝聚才干就越强。常用的凝聚剂为明矾， AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3。采用凝聚的方 法得到的凝聚体颗粒比较小。
改动发酵液的性质，以利于固液分别。经过酸化、加热、 以降低发酵液的黏度。
经过参与絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的 颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰 胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然的有机高分子物质，如壳 聚糖和葡聚糖的聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生 物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮 凝法常可得到粗大的絮团。
Supercritical Fluid Extraction
6; 固体吸附： 是物质从液相〔发酵液〕到固相〔吸附剂〕发生物质的转移。此法 用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分别和提取。 按照吸附剂的作用原理：分为三大类。 A物理吸附： 依托范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛 和氧化铝等。 B静电吸附： 借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。 C: 亲和吸附： 在树脂上嫁接一个能与要分别的物质发生特异性反响的配基。
二、发酵液的固液分别
经过固液分别，去除了发酵液中的固相 物质，为后续过程提供廓清或干净的原 料液体。通常采用的单元操作为过滤和 离心。
高中生物《原生质体的分离》最新PPT课件
5、影响原生质体数量和活力的因素
（1）供试材料及预处理方法。根据不同材料的不同性质，确定 相应的预处理方式。 （2）离心条件：离心次数、离心速度、离心时间。 （3）酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、渗透压、光照和温 度、持续时间等。
5、影响原生质体数量和活力的因素
（3） 酶解条件：酶质量、组合、渗透压、pH、浓度、光照和温 度、持续时间等。
材料的预处理可以改变细胞的生理状态，增加细胞膜的强 度，达到提高分离的效率和减少原生质体损伤等。如在酶解前 预先发生质壁分离，因为此时原生质体收缩封闭了胞间连丝， 避免了细胞内容物的流失。
1、材料选择和预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高 某些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株在黑暗下培养12 h后分离的原生质体才能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片在黑暗下处理48 h后分离原生质体才能 获得高产量。
细胞是： • 构成有机体的基本单位 • 具有自我复制的能力，是有机体生长发育的基础；(有机体都是由细胞构成） • 代谢与功能的基本单位，具有完整的代谢和调节体系，不同的细胞执行不同
的功能； • 遗传的基本单位，具有发育的全能性； • 没有细胞就没有完整的生命
生物分类系统
三界系统 Haeckel 1894
易摄取DNA，染色体，细胞器，病毒等外源遗传物物快质速。繁殖、植物
2、开辟杂种新途径：是获得细胞无性系和选育远突缘变遗体传的重优组良、起转
基因以及品种改良
始材料，还可通过诱导形成杂种细胞。
和创造新品种等方
3、定向培养：将纯化后的原生质体转移到适当面条具件有下广，阔使的原应生用
质体适合于遗传转化、细胞融合、生理研究、体前胚景发。生、器官
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
感谢您的观看
THANKS
实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
原生质体分离试验方法ppt
原生质体的应用领域
总结词
原生质体在植物遗传改良、药物筛选、生物材料制备等 领域具有广泛的应用价值。
详细描述
原生质体是研究植物细胞生理、生化特性和遗传特性的 重要工具，可以通过遗传操作进行基因敲除、转基因等 操作，从而改良植物的性状。此外，原生质体也可以用 于药物筛选，通过药物处理后观察原生质体的生理变化 ，筛选出具有药效的化合物。另外，原生质体还可以用 于生物材料制备，如利用原生质体制备生物可降解材料 等。
提高原生质体再生效率的方法
选择适宜的酶解条件
使用适当的酶处理组织，以获得高活性的原生质体。
添加生长调节剂
在培养基中添加植物生长调节剂，促进细胞的分裂和 再生。
优化培养条件
控制温度、光照、湿度等环境因素，为原生质体的再 生提供最佳条件。
06
原生质体分离试验的应用前景与挑战
在遗传工程中的应用
基因编辑
详细描述
原生质体是细胞去除细胞壁后所形成的半透性结构，它保留了细 胞的完整细胞膜和细胞器，是研究细胞生理、生化特性和遗传特 性的重要工具。
原生质体的特性
要点一
总结词
原生质体具有半透性、较高的渗透压、易于培养和遗传操 作等特性。
要点二
详细描述
原生质体由于去除了细胞壁，因此具有半透性，可以允许 小分子物质和水分进出细胞，同时也可以允许大分子物质 通过胞吞和胞饮的方式进入细胞。此外，原生质体还具有 较高的渗透压，能够维持细胞的正常生理功能。另外，原 生质体也易于在培养基中进行培养，并且可以通过遗传操 作进行基因敲除、转基因等操作。
化学法的优点是操作简便、成 本低廉，适用于某些特定的细 胞类型。
化学法的缺点是化学物质可能 会对细胞造成损伤或破坏细胞 内部的代谢平衡，且分离效果 不稳定。
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植物原生质体的分离与纯 化
实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶解时酶液的组成及浓度如何确定 ③ 研究原生质体的意义是什么？
4 纯化： 1 ）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心 管中。 2 ）纯化 - 漂浮法：用比原生质体比重大的 20% 蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的 表面。（还有沉降法）
过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体 弃上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮 在一新离心管中加入6~8 ml的20%蔗糖盐溶液，将原生 质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面 1000rpm，3min离心，漂浮原生质体 原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于 另一离心管中
实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶解时酶液的组成及浓度如何确定 ③ 研究原生质体的意义是什么？
4 纯化： 1 ）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心 管中。 2 ）纯化 - 漂浮法：用比原生质体比重大的 20% 蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的 表面。（还有沉降法）
过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体 弃上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮 在一新离心管中加入6~8 ml的20%蔗糖盐溶液，将原生 质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面 1000rpm，3min离心，漂浮原生质体 原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于 另一离心管中