第九章 生物大分子的分离与纯化技术

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9.3.4 疏水作用色谱的应用
• 只用于生物大分子的分离，不用于有机小分子 分离。 • 优点：首先是其色谱条件温和，蛋白质活性回 收率高，一般都在85%以上。其次是不用有毒 和昂贵的有机溶剂。第三是分离性能好。第四 含高浓度盐的样品可以直接进疏水作用色谱柱 进行分离。第五对生物工程产品的粗品可直接 上样，一次完成蛋白质的初步分离、脱盐和复 性三个目的。
加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+ • 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右 离解。 • 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 ③温度：常温
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④ 检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和220nm。 • 280nm检测中含有含苯环的 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的 蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测 是普遍 使用的波长。 • 220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。 • 核酸可在260nm检测。 ⑤ 洗脱方式：梯度洗脱——逐渐增加洗脱强度。
• 有机小分子与蛋白质在反相色谱中的洗脱曲线不一样。以B液的百分含量和蛋 白质的容量因 子k′作图，发现蛋白质在图上有一突跃。即在某一区间内，B液含 量的一个较小的变化会引 起某个蛋白质容量因子很大的变化。在此区间内B液一 个小的增大使k′很快减小，使蛋白质 从基本上不移动到很快洗脱下来。不同蛋 白质到达这突跃区时所需B液的浓度不同，从而可 以得到分离。 • 蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗 脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。而有机小分子的反相 色谱中未发现 此种突跃现象。实际工作中梯度洗脱时间约为20～60min，B液的 变化速度约为每分钟5%～15%。
在疏水作用色谱中，溶质的容量因 子K’与流动相盐浓度等因素的关系：
从盐考虑： lnK' = lnK'0 + S C盐
纯水中蛋白质的容量因子 常数
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盐的摩尔浓度
可见：盐的摩尔浓度 增大，蛋白质在HIC 柱上的保留长。
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从水考虑： lnK' = lnI － Z lnC水
均为常数 水的摩尔浓度 lnI与Z大小反映了蛋白质疏水性的大小和洗脱的难易。疏水性大，保留值也大。 水浓度增大，保留时间缩短。
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2、流动相的pH值
一般地pH 4～8 ； 常选 pH 7左右。
3、温度
一般在常温或低于常温下操作。 HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。 ①在HIC体系中蛋白质处在活性状态， T↑使蛋白质的团状结 构伸展，暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留 值 增大。（其他色谱，T↑保留增大） ② T↑传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用） 总之，在疏水色谱中，①比②大，∴ T↑，保留增大。 4、洗脱方式 梯度洗脱。（高浓度盐→低浓度盐）
9.3.3 色谱条件
主要有：a.具有中等疏水性表面的填料；b.盐析性盐的水 溶液为流 动相；c.紫外检测器检测，检测波长220或280nm， 核酸在260nm；d.流动相pH值接近中性；e.由高盐浓度到低 盐浓度的梯度洗脱，梯度时间20～60min；f.常温或4℃下操 作。 2015/12/7 12
1、流动相的组成
• 有A液和B液两种。 • A液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定 pH值。常用的A液为1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～ 0.05mol/L磷酸盐缓冲液； • B液：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度 相等。常用的B液为0 .01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液。 • 盐有两类。 • 盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的 疏水作用而析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而 保留在柱上。不失活，溶解度减小。常用： (NH4)2SO4 • 盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。 如硫氰酸盐、盐酸胍等会。
④不同的蛋白质在相同流 动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情 况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到 分离。
结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋 白质就容易被洗脱。
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9.2.2 色谱条件
①固定相：常用C4 ～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为 填料。孔径25～50nm。 ②流动相： 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）
第九章 生物大分子的分离与纯化技术
9.1 概述
9.2 蛋白质的反相色谱（RPC）
9.3 疏水相互作用色谱
9.4 亲合色谱
9.5 电泳分离技术
9.6 超离心技术简介
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第九章 生物大分子的分离与纯化技术
9.1 概述
生物大分子是指蛋白质(包括酶)、多聚糖和核酸类化合 物，一般分子量从几千到几百万。它 们广泛存在于各种生 物体内，与各种生命活动息息相关。除了天然存在的外， 还有生物工程培养和发酵的。生物大分子具有十分重要的 生理功能和应用价值。 研究生物大分子的结构、功能及应 用已成为生命科学的一个关键问题。蛋白质药物及其他生 物制品在医药方面有着十分重要的应用前景。不论从动植 物和微生物体内提取或用生物工程 制备的生物大分子产品， 都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离和纯化。
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9.2.3 应用
最大优点：分离度最高； 最大缺点：容易使蛋白质变性失活。 例子：人的胶 原蛋白I型α1和α2键的色谱分离 图 9-1 人的胶原
蛋白I型α1
和α2键的 色谱分离
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9.3 疏水相互作用色谱
概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相， 用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法，叫疏 水相互作用色谱(Hyd rophobic Interaction Chromatography,HIC)或疏水作用色谱。
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例如：基因重组人干扰素r是 一种基因工程产品，其粗 品是7mol/L盐酸胍溶液。 干扰素在盐酸胍 溶液中处 于可逆性失活状态。因盐 浓度太高无法直接上其他 柱，除去盐酸胍后干扰素 又容易 析出来。若使用疏 水作用色谱柱，将此样品 直接进样，既脱除了盐酸 胍，又达到 了复性的效果。 而且一步分离后，干扰素 纯度可达到90%。
9.3.1 分离原理
在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2， -CH3 ，-ph等）。而蛋白质分子是一个外部有一 亲水层包围，内部有疏水核的具有四级结构的 复杂体系。蛋白质表面亲水性很强，但也有一 些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在疏 水基团较多的裂隙。在不同的介质中裂隙的伸 展和收缩程度不同，从而使疏水基团暴露的多 少也 不同。疏水色谱是利用盐水体系中样品组 分的疏水基团和固定相的疏水配基之间疏水作 用力 的不同而达到分离的目的。
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图 9-2 IFN-r粗品的HIC分离
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疏水作用色谱与反相色谱的区别
• 相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。 • 区别：填料不同（HIC，表面中等疏水性作为配基； RPC，表面是烷基C4－8等疏水性强的为配基。） 疏水力不同（HIC，疏水作用较弱；RPC，强）。 两色谱中洗脱液主要成分不同（正是上面的差异引起的）
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9.4.2 填料 （由基质、间隔臂和配体三部分组成）
间隔臂 作用：使配体伸离基质表面一定距离， 即克服空间位阻，使配体与生物 大分子容易接近和作用。一般为： 4～6个亚甲基。 配体 要求：①对被分离生物大分子应具有高 基质 的生物特异吸附作用； 要求：多孔或网络型凝胶结构 ②与基质或间隔臂之间要用化学 反应形成共价键。 外径 25～100nm。
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OH
OCH2CH3 Ph
蛋 白 质
CH3
NH2 Ph COOH
OH 蛋白质疏水基团分布示意图
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配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）： • 用“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。∵生物物质界 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 讨论
9.2 蛋白质的反相色谱（RPC）
9.2.1 分离机理
蛋白质的反相色谱中： ①用C4～C8烷基作配基（将配基键合在固定基质上作为固定相）为固定相， 以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动 相极性大于固定相）。 ②蛋白质分子中既有亲 水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏 水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。 ③在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶 质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填 料（疏水性配基）的亲合。
亲合色谱填料示意图及说明
AC填料的基质：分两类。一类为有机聚合物，用得最多的是多 糖聚合物，如纤维素 ，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙 烯酰胺也是一类常用的基质。多糖基质表面羟基 密度大，易制 得柱容大的填料，而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。 但这类基质机械 强度低，不耐高压。第二类基质是多孔玻璃和 硅胶。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基的非特 2015/12/7 19 异性吸附难以完全克服。
结论 疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上的保留性质是四 个可变因素综合作用的结果。这四个因 素是：样品分子、 填料、流动相组成及性质和温度。
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9.3.2 填料
由基质和键合在基质上的配基两部分组成。（基质＋配基）
基质：有“软”、“硬”两类，它们必须有25～100nm的内孔 径或者有较大间隙的网 状结构（孔径要大）。 软基质：交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子 聚合物。 硬基质：主要是大孔径硅胶。 配基：是一些含氮和氧原子 的中等疏水性基团； or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。
洗脱强 保留强 水溶性有机溶剂 反相色谱洗脱液 使溶质与填料的疏水 作用减弱，洗脱加强 水 盐析性盐 疏水作用色谱洗脱液 使溶质与填料的疏水ห้องสมุดไป่ตู้作用增强，保留加大
∴在HIC中可以加入少量有机溶剂以增强流动相的洗脱能力； 在RPC中加入盐来改变蛋白质的保留值
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9.4 亲合色谱 (Affinity Chromatography) AC
双水相萃取 膜分离 盐析法 电泳法 超离心技术 色谱法（分离生物大分子的液相色谱法） 离子交换色谱 排阻色谱 其技术参见第七章。注意： 固定相、流动相、PH值的选择 其技术，参考前面章节
疏水相互作用色谱 亲合色谱 反相色谱（液相色谱中，分离性能最好的）
本章以下的方法主要以蛋白质及酶为分离对象。
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9.1.1 生物大分子分离纯化的特殊性
1、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构 变化发 生。 2、多孔填料必须使用大 孔径基质。 3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选 择色谱条件时不能随便套用小分子的 条件。
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9.1.2 生物大分子分离技术
9.4.1 亲合色谱的原理 • AC是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种特异的有选择 性的亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类 生物大分子有吸附，对其他物质无吸 附作用，洗脱时先 被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗 脱下来，从而达到分离目的。
亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊的配基（配位体）制得。例如 酶的底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物的抗原，激素的结 合蛋白等都可以作为 配位体用于分离对应的酶，抗体和激素。有些配体 可以用于一类化合物的吸附分离。如伴刀豆球蛋白可以特异地吸附糖蛋 白；三嗪染料作配基也会对某些蛋白质有选择性吸附。 配体与分离对象的作用：是一种特异的生物亲合力，是配体与被吸物之 间范德华力、疏水力、静电力和其他力的综合作用的结果。这种综合作 用力是有选择性的，只对一个或一类生物大分子起作用，对其他物质不 起作用。故AC选择性很高。