乙肝表面抗原定量测定的方法学验证
乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法
乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法前言乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisB virus , HBv ）引起的传染性疾病，在我国人群中感染率较高，，是严重危害人民身体健康的常见传染病之一。
对乙肝的诊断主要以实验室检测乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）为主，检测方法主要有酶免疫法、反向间接血凝法、放免法、化学发光法、免疫荧光法等，目前应用较广、较普及的是酶免疫法。
本标准所使用的缩略语为HBV 、HBsAg 。
本标准从2002 年7 月1 日起实施。
本标准由卫生部医政司提出。
本标准由北京大学医学部人民医院肝病研究所负责起草。
本标准主要起草人：陶其敏、全文斌。
本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。
中华人民共和国卫生行业标准中华人民共和国卫生部2002-04-20 批准2002-07-01 实施乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法WS / T 223 一2002Guidelines for enzyme immuno 一assay of hepatitis B surface antigen1 范围本标准规定了血清HBsAg 酶免疫检验方法（两步法）中相关的技术要求。
本标准适用于各基础、临床实验室和流行病学研究中血清HBsAg 测定。
2 方法选择2 . 1 常用方法HBsAg 的酶免疫检验方法根据反应模式可分为“一步法”和“两步法”两种方法。
“一步法”是将待测样品和酶标记抗体同时加人到反应孔中进行反应，从而达到快速的目的；“两步法”则是先将样品加人到反应孔中，待反应结束后再加人酶标记抗体，从而使待测样品的“捕获反应”和酶标记抗体的“酶联反应”分开进行，因而反应更加稳定、重复性也更好。
2 . 2 推荐方法由于“一步法”存在产生“前带现象”的可能，故在本标准中不列为推荐方法；本标准推荐使用酶免疫“两步法”。
2 .3 方法原理本标准推荐使用酶免疫“两步法”检测HBsAg ：将抗HBs 的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清，如其中含有HBsAg ，则可与固相上的包被抗体结合；洗板去除不参加反应的无关蛋白成分后，加人酶（如辣根过氧化物酶）标记的第二株抗体使之与血清中HB 、Ag 反应，在固相载体上形成包被抗体一血清中HBsAg 一酶标记抗体的复合物（即双抗体夹心）；再加人底物后，酶催化底物，产生显色反应，根据显色反应颜色的深浅可判定血清样品中HB 、Ag 的有无及相对含量。
乙肝表面抗原的方法学评价
定性检测的重复性研究能够评估检测方法的精密度，而精密度是检验项目测定中最基本的性能指标，我们检测的批内重复性和批间重复性的CV值均小于规定的允许范围，性能符合要求。
定性试验用阴、阳性符合率来评价结果的准确度，我们使用2010年卫生部临检中心的三次感染性疾病血清标志物A类室间质评回报结果进行统计，符合率为100%。
同时我们对选取的HBsAg阳性（包括临界弱阳性标本）和阴性血清标本进行检测，阳性、阴性符合率均为10 0%，检测性能符合要求。
说明该检测方法的准确性较好，能够满足临床诊疗的需求。
临界值是指实验结果处于阴、阳性分界点时的样本中分析物浓度值，低于该值判断为阴性结果，高于该值判断为阳性结果，对于定性试验，临界值是一个医学决定水平。
定性试验的临界值直接决定了实验结果的检出率，因此必须对厂家提供的临界值进行验证。
本实验室H BsAg±20%浓度水平的样本位于临界值95%区间内，结果说明试剂生产厂家提供的检测项目临界值基本准确。
综上所述，通过对HBsAg的批内重复性、批间重复性、临界值验证、阳性符合率、阴性符合率的评价和分析，证实该检测系统的性能卓越，具有高灵敏度和高特异性，能够满足临床检测的要求。
金标法乙肝表面抗原检测方法学探讨
金标法乙肝表面抗原检测方法学探讨《中华中西医杂志》2008年第06期作者单位：430065 湖北武汉，湖北中医学院医学检验与技术系【摘要】通过从灵敏度、特异性、准确性及稳定性等四个方面对金标乙肝表面抗原检测法进行方法学探讨，并分别用金标法及酶免疫法对1200例体检及临床标本进行检测，发现金标法检测血清中乙肝表面抗原特异性强，灵敏度高，与酶免疫法符合率为99.0%，且无需特殊仪器设备，简便快速，具有广泛应用价值。
【关键词】金标法；乙肝表面抗原乙肝表面抗原（hbsag）是乙型肝炎病毒外壳蛋白中的主要成分阳性是感染乙肝病毒的标志，是检查乙肝血清标志物中较重要的一项［1］。
近年来发展的金标法检测hbsag，与传统的酶免疫法（eia）相比，具有简便、快速、准确，不需要仪器设备等优点，能满足临床急诊快速出结果的需要，且较适合使用于流行病学调查，应用前景非常宽广。
1 材料与方法1.1 材料（1）金标试纸条：上海洪泰生物技术发展有限公司产品。
（2）hbsag灵敏度标准参比品：中国药品生物制品检定所产品。
（3）hbsag酶免疫诊断试剂盒，hbsag、hbcag、hbeag阳性对照血清：中外合资上海实业科华生物技术有限公司产品。
（4）血清标本：1200份体检及临床血清标本，其中乙型肝炎患者血清172份，健康人血清1028份。
1.2 方法（1）5ng/ml标准参比品用生理盐水分别稀释成4ng/ml,3ng/ml,2ng/ml,1ng/ml几种浓度，各取0.1～0.2ml置于洁净试管中，用金标法试纸条进行检测，严格按照说明书所述，将测试条有金标抗体端插入血清内，放置一定时间后观察结果。
（2）hbsag、hbcag、hbeag阳性对照血清各取3份，每份为0.1～0.2ml加入已备好洁净试管中，用金标法对各份血清进行检测。
（3）分别用金标法、eia法对1200份体检及临床血清标本进行检测。
（4）将金标试纸条各10条分置于37℃、室温（25℃）保存5天，做热稳定试验。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
输入标准品各浓度值, 以双对数法制备标准曲 线, 获取各孔的浓度值, 打印标准曲线图和 计算结果。
整理课件ppt
8
Absorbance(OD)
2.5 2
1.5 1
0.5 0 1
y = 0.4204Ln(x) + 0.09 R2 = 0.999
公司。
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4
3 溶液配制 0.01M pH7.4的PBS缓冲液：
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用 HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水 定容至1L即可。 质控品：
用PBS缓冲液将标准品配制成6.3、1.5ng/ml 三个质控品，每质控品1ml。
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5
试验方法
1 标准曲线各浓度的配制 用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、
0.5.0.25.0.125.0.0625ng/ml。
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6
2 测定方法 设计标准品、质控品及空白分配方案；
取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条， 按需要重新配制；
在相应孔中加入系列标准品、质控品及空
108.825 88.945 101.505 113.06 103.46 112.79 111.48 117.39 118.28 120.52 129.34 93.9 88.38 102.46 整理9课8件.5p6pt
平均回收率 RR(%)
103.159
116.092
102.528
SD(%) 9.15
整理课件ppt
3
三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较
三种方法检测乙肝表面抗原结果的比较发表时间：2012-02-02T14:50:30.183Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第12期供稿作者：金大伟富宏然高莉莉[导读] 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15%金大伟富宏然高莉莉（黑龙江省牡丹江市红旗医院检验科黑龙江牡丹江157011）【摘要】目的：通过乙肝表面抗原，比较三种方法学的优缺点。
方法：采用化学发光法检测乙肝，然后对阳性标本分别用酶联免疫吸附试验和金标方法复检。
结果：总数为13207份标本，化学发光方法检测表面抗原阳性的标本为1524份，ELISA方法复检后阳性标本数为1415，金标方法复检后阳性标本数为1241。
结论：灵敏度化学发光方法最高、ELISA方法居中、金标方法最差；操作金标方法最简单、ELISA居中、化学发光方法稍难；金标方法假阴性假阳性率最高。
因此，金标方法只能进行筛检，阳性或阴性都不能定诊。
【关键词】乙肝表面抗原；化学发光法；ELISA；金标法【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0156-01 中国是乙型病毒肝炎的高发国家,根据流行病学调查, 人群发生率较高, 表面抗原携带率约为15%［1］。
乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由Dane颗粒的外壳和直径22 nm的球型颗粒和管型颗粒所组成［1］。
HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物,也是诊断的重要指标之一。
HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。
值得注意的是在急性感染的恢复期,存在核心窗口期现象,即该时期HBsAg消失,抗- HBs还未出现的,此期可短至数天或长达数月。
目前检测乙肝有三种比较常用的方法学，即酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标法、化学发光法。
中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检测HBsAg。
乙型肝炎病毒表面抗原定量测定作业指导书
乙型肝炎病毒表面抗原定量测定作业指导书一、目的：规范乙型肝炎病毒表面抗原测定的标准操作程序，确保乙型肝炎病毒表面抗原测定的结果准确有效。
二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的乙型肝炎病毒表面抗原。
三、临床意义乙型病毒性肝炎是一种重要的公众危害性疾病，据估计全球范围内目前大约有3 亿乙肝病毒携带者。
感染乙型病毒性肝炎可引起广泛的急、慢性肝脏疾病，流行病学研究已经清楚地表明乙肝病毒与肝细胞癌的发生有联系。
HBsAg是乙肝病毒颗粒（HBV）的外壳成分，为大小不一的多肽。
感染乙型肝炎病毒后，机体会产生各种不同模式的抗原、抗体血清学免疫应答反应。
通过检测这些标志物，不仅可以诊断感染，而且还可以判断疾病的进程和预后。
HBsAg是HBV感染后第一个标志物，是提示样本是否有潜在传染性的最好的间接指标。
四、方法原理本产品采用双抗体夹心法原理进行检测。
用抗-HBs 抗体包被磁微粒，用辣根过氧化物酶标记的抗-HBs抗体制备酶结合物。
通过免疫反应形成抗体-抗原-抗体-酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与HBsAg含量成正比。
五、标本的采集与处理5.1.采用正确医用技术收集血清/血浆样本，推荐对于使用普通管采血的样本，离心前样本应37℃孵育至少1h；对于使用促凝管采血的样本，离心前样本应37℃孵育至少0.5h，离心条件10000g/min，10min；对于使用抗凝管采血的样本，离心条件10000g/min，10min。
抗凝管推荐使用肝素作为抗凝剂，避免使用枸橼酸钠和EDTA抗凝剂。
5.2.样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。
5.3.溶血或脂血的样本不能用于测定。
5.4.样本收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2~8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。
使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证论文
毕业论文题目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名：学号：专业：指导教师：教师职称：研究起止日期：研究提交日期：二○一三年十一月目录毕业论文乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要 (1)英文摘要 (1)前言.................................................................................................... . (2)1.材料与方法 (3)1.1试剂盒 (3)1.2仪器 (3)1.3方法 (3)1.3.1 溶液配制 (4)1.3.2 铺板方案 (4)1.3.3 加样步骤 (5)2. 结果 (6)2.1 标准曲线与线性 (6)2.2 准确度（回收率）的验证 (6)2.3 精密度的验证 (7)2.3.1 板精密度的验证 (7)2.3.2 板间精密度的验证 (8)2.4 检测限（LOD）计算 (10)3. 讨论 (1)3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 (10)3.2 常用定量分析方法 (11)3.3 方法概述 (11)3.4 方法学验证容 (12)3.5 结果分析及应用评价 (13)参考文献 (14)综述.................................................................................................... . (15)致.................................................................................................... . (18)乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要目的：对蓝图生物工程生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。
结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。
关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。
ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。
1. 材料与方法1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。
低水平乙型肝炎病毒表面抗原检测的三种方法学探讨
•临床研究•低水平乙型肝炎病毒表面抗原检测的三种方法学探讨谢小红，路瑞静，江凡，周喜友，周坤朋，王丰！(深圳市宝安区妇幼保健院检验科，深圳518102)［摘要］目的对低水平乙型肝炎病毒表面抗原的三种方法学进行探讨。
方法选取酶联免疫吸附试验(ELISA)检出的7606例阳性样本作为研究对象，采用胶体金法进行复检，若检测结果与ELISA不一致，再采用化学发光免疫分析法(CLIA)进行检测，"CLIA作为参考方法$结果在ELISA检出的7606例阳性样本中，胶体金法复检阳性7228例、阴性378例；复检阴性样本继续采用CLIA法进行检测，其中阳性183例、阴性195例；相对于ELISA，胶体金法检测HBsAg的灵敏度为95.03% (7228/7606)$在胶体金法为阴性的低值样本中，相对于CLIA,ELISA检测HBsAg的阳性预测值为4841%(183/378)，胶体金法检测HBsAg的阴性预测值为5159%(195/378)$在低值样本中，ELISA的S/CO值和CLIA定量值分布趋势一致，但定量值越低一致性越差$结论在检测低水平乙型肝炎病毒表面抗原时各方法性能指标差异较大。
实验室应按此来确定不同方法的不同用途，避免漏诊和误诊$［关键词］乙型肝炎表面抗原；酶联免疫吸附试验；化学发光；胶体金；低水平DOI：10.3969/j.issn.1009-5519.2020.25.049文章编号：1009-5519(2020)25-0125-04文献标识码:B乙型病毒性肝炎(HBV)是危害人类生命健康的主要传染病之一。
据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV,其中慢性HBV感染者有2.4亿人%1〕。
在我国肝硬化和肝细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为60.00%和80.00%%2。
有研究显示，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度在5IU/mL 以下的低水平感染者占HBsAg阳性人群的13.5%,并且HBsAg浓度在1ng/ml以下者在阳性人群占&4%，占低水平感染者的61.9%3#因此，对低水平HBsAg的准确检测在临床诊断、治疗以及流行病学调查中具有重要意义。
使用不同方法检测乙肝表面抗原的对比分析
使用不同方法检测乙肝表面抗原的对比分析发表时间：2013-07-22T09:03:18.233Z 来源：《医药前沿》2013年第15期供稿作者：陈开兰黄仕辉[导读] 此次研究对象年龄段在19—38岁，属性活跃期人群，为宫颈炎好发人群。
陈开兰黄仕辉（贵州航天医院贵州遵义 563003）【摘要】目的：分析化学发光法（微粒子酶免法）与酶联免疫吸附实验（ELISA）及胶体金免疫沉析法检测乙肝表面抗原的差异性。
方法：利用雅培i2000化学发光分析仪测定病人标本，记录乙肝表面抗原的定量结果，将同样的标本用酶联免疫吸附实验及胶体金检测，记录检测结果，经统计学处理，对三种方法的测定结果进行比较。
结果：三种方法测定乙肝表面抗原的结果存在差异，化学发光法的阳性检出率较ELISA法及胶体金免疫沉析法高。
结论：对ELISA法及胶体金免疫沉析法检测乙肝表面抗原处于临界状态的标本，应使用化学发光法检测，以提高结果的准确性，更好的为临床提供诊断依据。
【关键词】乙肝表面抗原微粒子酶免法 ELISA 胶体金免疫沉析法【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）15-0102-02 Comparative Analysis on Hepatitis B Surface Antigen through Different Detecting MethodsCheng Kailan Huang Shihui ( Guizhou Aerospace Hospital Zunyi Guizhou Province 563000 )【Abstract】 Objective：Analysis of chemiluminescence (microparticle enzyme immunoassay method) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoprecipitation, analysis of colloidal gold was detected difference between hepatitis B surface antigen.Methods： Abbott i2000 using chemiluminescence analyzer patient specimens. Record the results of the quantitative hepatitis B surface antigen, Will have the same specimens by enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold detection,Record test results, Statistical analysis,Determination of the three methods were compared.Results：Three Methods for measuring the results of hepatitis B surface antigen differences,Chemiluminescence than the positive rate of ELISA ,and immunogold method with high precipitation..Conclusion：On ELISA, and immune precipitation of colloidal gold assay of hepatitis B surface antigen in the critical state of the specimens,Chemiluminescence detection should be used to improve the accuracy of the results,the better the basis for the clinical diagnosis.【Key words】 Hepatitis B surface antigen Microparticle enzyme immunoassay Method ELISA Immungold precipitation method 近年来，随着医学检验技术的发展，乙肝表面抗原的检测已成为住院病人的普查项目，其操作方法越来越简便、快速、准确，大大提高了实验室的工作效率，也为临床诊断与治疗提供了可靠的依据。
乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒性能验证方案
乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒性能验证方案报告人：时间：批准人：时间：宿迁市中医院检验科目录一、系统信息二、验证目的三、检测原理四、验证过程五、验证结果六、验证结论七、参考文献八、附件一、系统信息●项目名称：乙型肝炎病毒表面抗原（酶联免疫法）●设备名称及型号：AutoBio phomo酶标仪/Anthos fluido洗扳机●试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）批号：201610402 有效期：20171024 厂商：上海科华生物工程股份有限公司●质控品名称：康彻思坦HBsAg质控品 0.2IU/ml批号：201611007 有效期：20181121 厂商：北京康彻思坦生物技术有限公司二、验证目的验证HBsAg检测性能是否满足临床要求。
三、检测原理采用抗－HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗－HBs-HRP，当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗－HBs结合并与抗－HBs-HRP结合形成抗－HBs-HBsAg-抗－HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
四、验证过程4.1 批内精密度选择康彻思坦HBsAg 0.2IU/ml浓度质控品，在一批检测内，重复检测10次（孔），计算所得S/CO值的均值和SD，计算批内CV%。
判断结论：批内精密度变异CV%应≤15%。
4.2 检测结果符合率4.2.1 按要求选择样品进行验证选取至少40例样本，结果为阴性和阳性的样品各20例，按常规样本检测程序进行检测，结果按下列公式进行计算，得到阴/阳结果符合率：敏感性：被测试剂盒测定真阳性数/(真阳性数+假阴性数)*100%特异性：被测试剂盒测定真阴性数/（真阴性数+假阳性数）*100%符合率：被测试剂盒测定（真阳性数+真阴性数）/（真阳性数+假阴性数+真阴性数+假阳性数）*100%4.2.2 结果判断：敏感性=100%；特异性=100%；符合率=100%4.3 检出限验证4.3.1 选取一个已知浓度的定值质控，按原倍、1:1 、1:2 、1:3、1：4、1：5……等稀释倍数进行稀释，将稀释后的系列样本按常规样本的检测程序进行检测，寻求S/CO最接近1但大于1的稀释度。
乙肝表面抗原定量测定的方法学验证
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名 Z P学号 0925400072班级 09级医学检验本科二班指导老师沈富兵二〇一三年四月乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。
方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。
结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。
结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。
【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。
乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。
酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。
此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。
乙肝表面抗原确证实验作业指导书
· 对于7.0≤COI≤30的有反应性标本
100μl标本+100μl证实试剂
100μl标本+100μl对照试剂 或·
对于COI>30的有反应性标本，标本先用Elecsys通用稀释液作1：20稀释。
100μl稀释的标本+100μl证实试剂
100μl稀释的标本+100μl对照试剂
平行测定PreciControl HBs Ag 2,以便对操作进行核对：
180μl PreciControl HBs Ag 2+20μl证实试剂
180μl PreciControl HBs Ag2+20μl对照试剂
充分混匀，将以上几种反应物15－25度温育30-60分钟或 2－8度温育过夜。
ElecsysHBsAg测定：将预处理标本置于仪器的标本区，记录标识数据。按ElecsysHBsAg试剂操作说明书进行检测。
2.标本要求
Elecsys HBsAg试验重复呈现有反应性的人血清或血浆标本。标本采集和准备与Elecsys HBsAg试验相同。
3.试剂、校准品、质控品和其他所需材料
采用罗氏原装配套试剂。
试剂：
瓶1：证实试剂（黑盖），2瓶，1.3ml。抗HBsAg>200IU/l，人血清。含
防腐剂。
瓶2：对照试剂（白盖），2瓶，1.3ml。人血清,抗HBsAg<3IU/l。含防
· 第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。
· 第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去。电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。
ELISA法检测乙肝表面抗原实验精密度研究
ELISA法检测乙肝表面抗原实验精密度研究摘要】目的探讨ELISA法检测HBsAg实验精密度的影响因素及实验精密度对检验结果的影响。
方法检测卫生部临检中心0.5ng/mL质控血清，计算精密度；比较手工操作与全自动酶免分析仪法检测的精密度；检测不同效价的阳性血清，比较精密度，并作统计学分析。
结果临界值附近的标本可能引起误判，手工操作与全自动酶免分析仪法检测实验精密度差异有统计学意义(ｔ=4.72，Ｐ<0.01)。
结论实验精密度的高低对酶免法检测HBsAg实验存在影响，检验结果的判定应设置灰区并进行复检或进一步检测。
【关键词】乙型肝炎表面抗原 ELISA法检测一前言乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏性损害，是我国当前最广泛、危害最严重的一种传染病。
经济发展的水平较底，卫生条件比较差是本病流行的基础。
本病遍及全球，乙肝表面抗原携带率，热带地区高于温带，男性高于女性，在未经免疫预防的国家里，儿童携带率高于成人，城市高于农村。
传染源主要是患者及乙肝病毒无症状携带者、经血液、性接触和生活密切接触都是传播的重要方式。
易感者感染乙肝病毒后约经三个月（6周至6个月）发病。
临床表现为、食欲减退、恶性、呕吐、厌油、腹泻及腹章涨，部分病人有发人发热、黄疸，约有半数患者起病隐匿，在查体中发现。
肝功能异常，血清乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒脱氧合糖核酸（HBVDNA）、乙肝病毒免疫球蛋白M(HBVIgM)、脱氧核糖核酸聚合酶均为阳性。
大部分乙肝病人经治疗后临床症状能消退，少数病程迁延或转为慢性，其中一部分可发展为肝炎后肝硬变甚至肝癌;及少数病人病程发展迅猛，肝细胞出现大片坏死，成为重型肝炎；另有一些肝炎感染者则成为无症状的病毒携带者。
实验研究表明，乙肝表面抗原（HBsAg）与乙型肝炎的发生有着密切的关系。
因为它是HBV的外壳蛋白，本身虽然不具有传染性，但它的出现常常伴随着HBV的存在，所以它是人体已经感染上HBV的标志。
乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒性能验证方案
乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒性能验证方案报告人：时间：批准人：时间：宿迁市中医院检验科目录一、系统信息二、验证目的三、检测原理四、验证过程五、验证结果六、验证结论七、参考文献八、附件一、系统信息● 项目名称：乙型肝炎病毒表面抗原（酶联免疫法）● 设备名称及型号：AutoBio phomo酶标仪/Anthos fluido洗扳机● 试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）批号：201610402 有效期：20171024 厂商：上海科华生物工程股份有限公司● 质控品名称：康彻思坦HBsAg质控品 0.2IU/ml批号：201611007 有效期：20181121 厂商：北京康彻思坦生物技术有限公司二、验证目的验证HBsAg检测性能是否满足临床要求。
三、检测原理采用抗－HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗－HBs-HRP，当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗－HBs结合并与抗－HBs-HRP结合形成抗－HBs-HBsAg-抗－HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
四、验证过程4.1 批内精密度选择康彻思坦HBsAg 0.2IU/ml浓度质控品，在一批检测内，重复检测10次（孔），计算所得S/CO值的均值和SD，计算批内CV%。
判断结论：批内精密度变异CV%应≤15%。
4.2 检测结果符合率4.2.1 按要求选择样品进行验证选取至少40例样本，结果为阴性和阳性的样品各20例，按常规样本检测程序进行检测，结果按下列公式进行计算，得到阴/阳结果符合率：敏感性：被测试剂盒测定真阳性数/(真阳性数+假阴性数)*100%特异性：被测试剂盒测定真阴性数/（真阴性数+假阳性数）*100%符合率：被测试剂盒测定（真阳性数+真阴性数）/（真阳性数+假阴性数+真阴性数+假阳性数）*100%4.2.2 结果判断：敏感性=100%；特异性=100%；符合率=100%4.3 检出限验证4.3.1 选取一个已知浓度的定值质控，按原倍、1:1 、1:2 、1:3、1：4、1：5……等稀释倍数进行稀释，将稀释后的系列样本按常规样本的检测程序进行检测，寻求S/CO最接近1但大于1的稀释度。
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乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名 Z P学号 0925400072班级 09级医学检验本科二班指导老师沈富兵二〇一三年四月乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。
方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。
结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。
结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。
【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。
乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。
酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。
此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。
我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.1.2 仪器及酶标板酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。
1.1.3 溶液配制⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。
⑵质控品：用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。
首先取450μl 的8ng/ml 的标准品到C1号EP 管中再向其中加入150μl 的PBS 缓冲液，即配制成了6ng/ml 的质控品，再取300μl C1号EP 管内的溶液到C2号EP 管内，再向C2号管内加入300μl 的缓冲液混匀。
即配制成了3ng/ml 的质控品。
接着取300μl C2号管内的液体到C3号EP 管内，再加入300μl 的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml 的质控品。
具体方法如下图1图11.2 检测方法1.2.1 标准曲线各浓度的配制⑴用PBS 缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml 。
⑵先取6个EP 管分别标记为对应的浓度。
⑶取400μl 标准品于标记为①的EP 管中，再取200μl ①号管内液体于②号管内再向②号管中加入200μl 的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml 的标准品。
⑷再从②号管内取200μl 的液体到③号管内，接着取200μl 的缓冲液到③号管内混匀，即配制成了2ng/ml 的标准品。
⑸从③号管内取200μl 的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl 的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml 的标准品。
⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml 、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl 、200μl 、400μl 备用。
具体方法如下图2图21.2.2 测定方法⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系列标准品、质控品及空白对照；C3 1.5ng/mlC2 3ng/mlC1 6ng/mlS6 0.25ng /mlS5 0.5ng/mlS4 1ng/mlS3 2ng/mlS2 4ng/mlS1 8ng/ml8 8 6 3 1.5 ○-4 4 6 3 1.5 ○-2 2 63 1.5 ○-1 1 6 3 1.5 ○-0.5 0.5 6 3 1.5 ○-0.25 0.25 ○-○-○-○-○-○-○-○-○-图3注：双线框区域为标准品,浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三线框区域为质控品，浓度依次为6、3、1.5ng/ml，粗框区域为空白对照加入的是PBS缓冲液，每个孔内加入的均是50μl。
⑵37℃温育30min，洗板4次；⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔；⑷37℃温育30min，洗板4次；⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃温育15分钟；⑹加入终止液，50μl/孔。
1.3 标准曲线制作及结果计算⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；⑵在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件；⑶选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。
1.4 统计学方法用Microsoft Excel处理实验数据。
2 结果2.1 测得的OD值如下表1.7390 1.6380 1.0850 0.6920 0.3380 0.01500.8840 0.8880 1.2170 0.6740 0.3530 0.00900.5360 0.5090 1.2180 0.6560 0.3380 0.01000.2720 0.2600 1.2330 0.6740 0.3470 0.00900.1490 0.1380 1.2480 0.6960 0.3430 0.01200.0620 0.0710 0.00900.0120 0.0020 0.0090 0.00900.0110 0.0090 0.0110 0.0100图4注：图4与图3相对应2.2 标准曲线图5由上图可得出如下结论：标准曲线以浓度为横坐标，以测得的OD值为纵坐标。
由对应浓度和OD值得出的散点连成一条直线后，散点基本都在直线上，说明散点的线性非常好。
在以后检测乙肝表面抗原浓度的时候可以根据测出的OD值在标准曲线上找出对应的浓度。
2.3 准确度（回收率）计算各质控品高中低三个浓度平均回收率分别为92.59%、100.887%、93.68% 都在正常范围内如表1所示。
ELISA 法检测VEGFR2-Fc 的回收率准确度（回收率）计算VEGFR2-Fc (ng/ml)测定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%) SD(%)6 4.998 83.3 92.595.306 5.637 93.95 6 5.642 94.033 6 5.715 95.25 6 5.787 96.45 3 3.093 103.1 100.887 2.603 3.005 100.167 3 2.918 97.267 3 3.005 100.167 3 3.112 103.733 1.5 1.377 91.8 93.68 2.071.5 1.450 96.667 1.5 1.377 91.8 1.5 1.421 94.733 1.51.401 93.4 表12.4 精密度计算2.4.1 板内精密度板内精密度质控品各浓度组的RSD 都小于15%，精密度良好，如表2所示。
板内精密度VEGFR2-Fc （ng/ml ）测定值 1 测定值 2 测定值3测定值 4测定值5RSD(%)6 4.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694±0.318 5.585 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.577 1.51.3771.4501.3771.421 1.4011.405±0.0312.210表22.4.2 板间精密度板间各组浓度质控品RSD 都小于15%，说明板间精密度达到标准。
如表3所示。
X S板间精密度VEGFR2-Fc （ng/ml ）测定值 测定值 测定值 测定值测定值 RSD(%) 64.9985.637 5.642 5.715 5.787 5.694±0.318 5.585 6 5.471 5.423 5.674 5.323 5.746 5.5274±0.177 3.202 6 5.773 5.674 5.782 5.547 5.667 5.689±0.096 1.687 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.577 3 2.815 3.335 3.187 3.221 2.933 3.098±0.2166.972 3 2.886 3.344 3.118 3.234 2.997 3.116±0.182 5.841 1.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.031 2.210 1.5 1.226 1.257 1.227 1.564 1.334 1.322±0.142 10.741 1.51.6651.2431.2361.541 1.3201.401±0.19213.704表32.5 检测限（LOD ）计算：取空白孔的OD 值的均数加2倍标准差。
空白孔的OD 值的均数=0.0098 空白孔的OD 值的标准差=0.0028 LOD=0.0098+2*0.0028=0.01543 讨论通过图4、图5和表1、表2、表3可知本次实验的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD 值都复合实际，且各数据都趋于理想，对此我们做出分析： HBsAg 是乙肝病毒感染后最早出现的血清标志物之一，因此HBsAg 的检测是诊断肝炎病毒感染的重要依据。
而针对这项检测的检测方法的灵敏度与高特异性的高低以及二者的结合程度是影响检验结果的重要因素，直接关系到临床诊断和用药，所以对HBsAg 的检测方法的建立和方法的验证是实验成败的关键所在。