第一章 兽医临床生化检验基本实验室技术

光谱分析技术的分类
火焰光度法 发射光谱 原子发射光谱法 荧光光谱法 光谱分析 技术分类 吸收光谱
紫外、可见光分光光度法
原子吸收分光度法 红外光谱法
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散射光谱：比浊法
(一)分光光度技术的基本原理 1、吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况： 一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透 过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0 之比称为透光度，即： T = I/I0 T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称 为吸光度即： A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
3．双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外， 其余成分与双缩脲试剂相同。 4．蛋白质标淮液（60～70g／L） 常用 牛血清白蛋白。
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操作 取试管4支，标明测定管（U）、标准管 （S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）， 按表操作。
21 混匀，37℃10min或25℃30min，波长５40nm，蒸 馏水调零，测各管吸光度(A)。
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（四）防腐
防腐剂：
浓盐酸：酸性防腐
甲苯：形成薄末防腐
冰醋酸：酸性，常用食物防腐剂
麝香草酚：抑菌防腐
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（五）血液的贮存

采血后应尽快地将血清（浆）与血细胞分离开，一 般不应超过2小时，并及时测定，必要时可置冰箱 保存。血清中多数代谢物和酶在室温下6小时，或 4℃加塞存放24小时，无明显变化。但要保存更久 则应冰冻或冰冻干燥。冰冻半年后，一般代谢物变 化较小，但酶的变化却较大。
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2、Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：
A = KLC
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
注意事项：1、容器清洁干燥 2、避免污染
3、及时送检和防腐保存。
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三、特殊标本的采集（临床医生采集） （一）脑脊液的采集：
脑脊液正常和病变形状：颜色、透明度、细胞化学成分
采集部位：腰椎、小脑延髓池 收集方法：收集于三支无菌试管中，第l管作细菌检查， 第2管作生化检查，第3管作细胞计数。
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（五）分光光度技术的定量方法
1.标准曲线法
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最 小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的 直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光 度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。
（1）防止溶血 （2）避免充血 （3）采血时只能向外抽，决不能向静脉内推，免 注人空气，形成气栓而造成严重后果。
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（三）抗凝
生化检验常用抗凝剂： 1、肝素：由于肝素钠具有带强负电荷的理化特性，能干扰 血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。 2、氟化钠+草酸钾：草酸钾可与血中钙离子生成草酸钙沉 淀，从而阻止血液凝固。氟离子可抑制糖酵解中的烯醇化 酶，防止糖酵解 3、EDTA：其盐可有效螯和合血标本中的钙离子，阻止凝 血，适用一般血液学检验。 4、枸橼酸钠：与EDTA同理，适用于凝血试验。
第一章 兽医临床生化检验的 实验室基本技术
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第一节 常用临床生化检验技术
光谱分析技术 电化学分析 电泳技术 层析技术 离心技术 自动生化分析技术
常用技术
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一、光谱分析技术 掌握：
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
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光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射 光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或 含量。
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试剂 1．6mol/L NaOH溶液 称取NaOH 240g，溶 于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水） 约800ml中，冷却后定容至1L，贮于有盖塑料瓶中。 若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2 周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经 滴定后，算出准确浓度再使用。 2．双缩脲试剂（Doumas） 称取硫酸铜结晶 （CuSO4· 5H2O）3g，溶于500ml新鲜制备的蒸馏 水（或刚煮沸冷却的去离子水）中，加入酒石酸钾 钠（NaKC4H4O6· 4H2O，用以结合Cu2＋，防止 CuO在碱性条件下沉淀）9g和KI（防止碱性酒石酸 铜自动还原，并防止Cu2O的离析）5g，待完全溶 解后，在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml，用 蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。室温下可 稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重 新配制。 19
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据Lambert-Beer定律，当液层厚度为 cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为 摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层 厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波 长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。
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（二）偏离Lambert-Beer定律的因素
应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。
年龄 妊娠 性别 昼夜节律的变化 体型 运动

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２、饮食和药物的影响
除了急诊或其它特殊原因外，一般主张空腹12小时以后取血
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二、尿液标本的采集
随机新鲜尿
尿液标
本分类
8-20 定时尿 20-8 24小时尿 3h尿
晨尿
餐后2小时尿 其它包括中段尿、 导尿、耻骨上膀胱 穿刺尿
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（六）防止溶血的办法 ①抽血器和容器必须干燥洁净，尽量使月一 次性抽血器（注射器）； ②不用或短时间使用止血带； ③抽血后取下针头再将血液沿容器壁徐徐注 入容器内； ④若用血浆应轻轻倒转容器与抗凝剂混匀， 切勿用力振摇。

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（七）影响检验结果的生物学因素（了解） １、生理因素的影响
步骤：大夫填写检验申请单
检验人员采集标本
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一、血液标本的采集
静脉血：是最常用的标本，静脉穿刺是 最常用的采血方法 血液标 本来源
动脉血：血气分析多使用（Ｐ０２，ＰＣ Ｏ２，pＨ）
毛细血管血：耳尖，用于需血量少的检验
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（一）、全血、血清与血浆的区别
答案 全血,血清与 血浆的区别 全血：包括液体成分的血浆和分散悬浮于其中 的血细胞. 血浆: 采集的血液标本，经抗凝处理后，通过 离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体。 血清:离体的血液凝固之后所释出的液体 。
粗略地说，血清与血浆的区别，主要在于血清不含 有纤维蛋白原。或者说血清缺乏参与凝血过程被消耗掉的 一些凝血因子和纤维蛋白，血清不可以再凝
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（二）采血方法（静脉）：
扎止血带 常规消毒
核对 容器准备 病畜准备体位 前臂肘 窝正中静脉采血 取针头，将血液沿管壁缓慢注入容器。
３０度一４５度角
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注意事项
5、显示器
是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 12 装置。
（四）分光光度计的操作方法
1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通 电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置 于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量 细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
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3．其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用 摩尔吸光系数分析等方法。
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（六）分光光度法应用举例（血清总蛋白的测定）
原埋 血清（浆）中蛋白质的肽键（—CO—NH—） 在碱性溶液中能与两价的铜离子作用生成稳定的紫 红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的 双缩脲（H2N—OC—NH—CO—NH9）在碱性溶液 中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为 双缩脲反应。这种紫红色络合物在54０nm处有明 显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈 正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即 可求得蛋白质含量。
1．光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2．化学因素：
浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。
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（三）分光光度计的基本结构
最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计
结构： 五大部份
光源
单色器
比色杯
检测器
显示器
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1、光源 光源定义：
指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光 源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良 好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的 变化。
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应用：
由于技术要求太高，费用昂贵，这类方法不直接用于鉴定 常规方法的准确性，只用于评价参考方法与一级标准品。
光源种类：
可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。
紫外光光度计常用氢灯作为光源。
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2、单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。
种类：
滤光片
棱镜
光栅
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3、比色杯
又称为吸收池或比色皿
材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成