PNA-FISH技术

医学科学设计与研究作业姓名：王祥璞学号：20166020268 班级：16届口腔基础医学检测并定位牙周致病菌的创新型方法：PNA-FISH技术Luzia Mendes 、Catarina Ferreira、 Miguel Goncalves Pinto 均毕业于波尔图大学牙科学院的牙周部。

Rui Rocha、Andreia Sofia Azevedo 、Nuno Filipe Azevedo毕业于波尔图大学工程院化学工程系的能源、生物科技、环境、工艺学实验室。

关键字PNA-FISH技术（肽核酸-荧光原位杂交技术）、组织浸润、伴放线放线杆菌（Pg）、牙龈卟啉单胞菌(Aa)、牙周疾病摘要目的：我们的目的是通过应用FISH(荧光原位杂交技术)开发肽核酸（PNA）探针，用以检测龈下菌斑和牙龈组织中的伴放线放线杆菌以及牙龈卟啉单胞菌，并对其位置进行定位。

方法：针对每种微生物设计各自的PNA探针，优化之后的PNA-FISH方法可以使得每种微生物和它们各自的探针（也就是PNA-FISH复合物）同时杂交。

在对Pg和Aa代表菌株进行测试之后，PNA-FISH方法就可以用来对患有重度牙周炎的患者收集的龈下菌斑和牙龈样本中的微生物进行监测。

结果：对于（Pg PNA1007和 Aa PNA235）两种探针而言最佳的杂交环境是59℃ 150分钟。

Pg PNA1007探针和 Aa PNA235探针的特异性和敏感性分别都达到了100%和99.9%。

临床样本的结果表明PNA-FISH方法可以监测并区分位于龈下菌斑和牙周组织内混合微生物群中的目标细菌。

讨论：这项研究为监测并定位临床样本中的Pg和Aa细菌提供了一种新的高精度的方法，并且仅需要短短的数小时。

通过使用这种方法我们就可以观测微生物菌落中的这些菌种在牙周袋内的空间分布，并且在活体牙龈组织中首次应用了FISH（荧光原位杂交技术）技术。

1.介绍牙周炎是由易感个体的龈下菌斑和宿主防御系统之间的失衡所导致的。

过去十年来有关牙周膜的研究都非常的重要，然而，因为多种微生物复杂的性质以及进行体内研究的困难，有关科研和诊断目的方面的性质依然具有挑战性。

现代的分子生物学方法已经取代了传统的培养方式，并且提供了一些新的资源，这些资源不仅仅可以区分单一的微生物，还对所有具有潜在致病性的群体也具有非常的重要作用。

在这种情况下，生物膜研究中FISH（荧光原位杂交技术）的应用得到了重视，因为它可以通过标记的DNA探针和细菌核糖体RNA进行杂交对微生物进行原位鉴定。

一些人已经通过使用这项技术在体内观测到了龈上、龈下牙龈生物膜中牙周病原菌的空间分布，以及他们入侵宿主上皮细胞的能力。

然而，这项技术提供的附加价值有助于了解生物膜的三维结构以及它们和宿主组织之间的关系，FISH过程中的一些限制强烈的影响了这种关系。

比如低细胞渗透、杂交亲和性以及靶向部位对DNA探针的可通过性。

这些限制经常引发靶向部位特异性和敏感性的缺失，并随之丢失很多重要的信息。

为了克服这些问题，核酸类似物，也被称为DNA模拟物，得到了发展。

在1991年Nielsen等人首先发现了PNA（肽核酸），随后在90年代晚期应用于微生物检测。

在这种DNA模拟物中，DNA带负电荷的磷酸糖骨架被一种中性的聚酰胺主链所替代，这种聚酰胺主链由N-（2-氨基乙基）甘氨酸单元所组成。

中性PNA链和互补RNA链之间电荷斥力的缺乏会使得PNA/RNA更迅速、更强烈的结合。

结果表明，PNA探针相比同类的DNA探针能更快的提升对靶序列的可访问性。

并且，PNA分子的疏水性更利于细胞通过生物膜基质的渗透和扩散。

PNA的使用给传统的FISH技术带来了更强、更高的特异性和敏感度。

因此，首先我们的目标是发展高特异性、敏感度的PNA探针对牙周病原菌进行原位检测，Pg和Aa是位于龈下菌斑的牙周相关致病菌中的两种细菌，这些牙周相关致病菌也会机械性的入侵口腔上皮细胞。

因此，这是针对本次调查研究的合乎逻辑的选择。

2.材料和方法2.1 目标菌种和培养的维持8个牙龈卟啉单胞菌（Pg）过滤、临床分离、分类培养都是由Mike Curtis 和Koji Nakayama两位教授提供的。

3个伴放线放线杆菌菌株（Aa）由Casey Chen教授所提供。

所有的菌株（表2）都保存在添加了5%去纤维蛋白羊血的胰酶大豆琼脂（TSA）中，并将其放在37℃的厌氧环境下进行培养，每5-7天在新鲜的培养板上对聚集的菌落划线。

2.2 探针的发展设计针对每个微生物的PNA探针，首先用免费可行的Primrose（樱草花）程序区分出潜在有用的寡核苷酸和15个碱基对，Primrose（樱草花）程序和核糖体数据库项目II（RDP II ）的16S rRNA数据库是相连接的。

序列的选择是基于五个随机选择的菌株16S rRNA基因的比较。

为了避免丢失测试的五个随机菌株的感兴趣部位的可能序列。

其次，也为了更好的达到我们的目的，我们通过应用一些标准挑选出最好的PNA-FISH探针。

也就是说，目标微生物的检测数高一些并且非目标微生物的检测数低一些；探针的内部并没有自我互补的结构；两种探针拥有相似的预期的解链温度以及高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量。

最后，所选的序列合成Pg和Aa PNA探针的末端，它们的末端通过一个双 AEEA连接臂分别与Alexa Fluor（一种荧光标记试剂） 488和594相连接。

2.3 理论灵敏度、特异性以及亲合力评价使用更新后的RDP II（核糖体数据库项目II）数据库对理论灵敏度和特异性进行评估，并通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的搜索进行确定，网址是/BLAST/.靶向序列至少要拥有1200个碱基对并且要有良好的质量。

总之，理论的敏感度和特异性是通过公式目标数/总的目标数 *100 以及非目标数/总的非目标数 * 100 来估算的，其中的“目标数”是代表被寡核苷酸探针检测出的目标菌株的数量，“总目标数”是代表数据库中所显示的目标菌株的总数量，“非目标数”是代表没有被寡核苷酸探针检测出来的非目标菌株的数量，“非目标总数”代表的是数据库中所显示的非目标菌株的总数量。

亲和力是基于由Fuchs 等人所制定的16S rRNA靶向图的荧光寡核苷酸探针的可访问性来评估。

2.4 PNA-FISH多元化协议的发展在对临床样本进行测试前每个设计的探针都会进行测试和优化。

杂交的方法是在Almeida等人所报告程序的基础上进行了一些改良。

对杂交的时间和温度进行了调整以求两种微生物能同时达到最强的信号（多重PNA-FISH）。

首先，我们在每个目标菌种的单纯培养中评估PNA-FISH协议。

在每种情况下，从TSA培养板中收集培养了3天的细胞，悬浮在无菌水中，之后涡旋1分钟。

用3孔载玻片，每30μL悬液放置在55℃的温度下15分钟，随后室温下沉浸在4%的多聚甲醛中，之后是50%的酒精，每次10分钟。

固定涂片随后用20μL的杂交液覆盖，杂交液中含有含10%硫酸葡聚糖、10mM(毫摩尔)氯化钠、0.2%聚乙烯吡咯烷酮、5mM（毫摩尔）EDTA二钠、0.1%Triton X-100（一种非离子型表面活性剂）、50mM(毫摩尔)Tris–HCl（三羟甲基氨基甲烷）、200 nM（纳摩尔）PNA探针。

将盖玻片盖上，把玻片放在潮湿的房间中59℃ 150分钟进行孵育。

在经过杂交后，移除盖玻片，浸没玻片并保存在预热（59℃）的含有5mM(毫摩尔)Tris碱、15mM(毫摩尔)氯化钠、0.1%Triton X-100（一种非离子型表面活性剂）的洗涤液中30分钟，随后在使用显微镜之前放在一个阴暗的地方进行空气干燥超过24小时，每个实验的负调控都是通过使用不含探针的杂交溶液完成的。

其次，测试两种探针分类学上相关的微生物以及（或者）可能的口腔群体。

最后，为了确保每个菌种的探针都能在一个多元化的过程中保持各自的生物学行为，将含有两种PNA探针的混合物同时施加在相应的两种菌种（Pg和Aa）的混合玻片上.为此，对来自每个菌种的10μL混悬液进行混合并且涂到玻片上。

按照上述的进行杂交。

用PNA-FISH对临床样本中的Aa和Pg进行定位和区分。

图-1 16S rRNA的序列与单碱基错配以及Aa PNA235 、 PgPNA1007 部分对齐，杂交的情况在右边显示。

图-2 在经过PNA-FISH和荧光显微技术处理之后的Pg（绿色）和Aa（红色）的单纯性培养.2.5 临床样本的收集临床样本的收集是来自于五个参加了波尔图大学临床牙科医学院的成年患者的样本。

所有的患者都被诊断为患有重度牙周炎，他们原本都是健康的，在过去的3个月里并没有进行任何有关抗菌方面的治疗。

我们所选择的这种便利性的非概率样本只基于研究者面对两种微生物在重度牙周炎中的高检测率时的批判性判断。

我们在收集样本之前都获得了患者的同意，按照规定，这项研究由波尔图牙科学院的伦理委员会批准。

用无菌的Gracey刮治器收集龈下菌斑的样本，随后用棉卷隔离牙齿并用无菌棉球去除龈上菌斑，样本悬浮在无菌生理盐水中并立即进行处理。

在牙周手术期间或者在拔除没有保留价值的牙齿时收集牙龈样本。

牙龈样本放置在4%的多聚甲醛中并且在4℃的温度下储存以备下一步的使用。

2.6 临床样本中验证PNA –FISH龈下菌斑悬浮液在10000XG（相对离心力）下离心5分钟。

在被再次离心之前，这些颗粒再悬浮在400μL 4%的多聚甲醛中1h.固定的细胞随后再悬浮在500μL 50%的乙醇中并储存在20℃温度下直到下一次使用。

杂交的时候，将一份30μL的固定细胞样本涂抹到3孔玻璃载玻片上并进行空气干燥。

牙龈组织活检是将其包埋在石蜡中，切成3μm的厚度，并放置在显微镜的载玻片上。

在杂交之前，玻片先放在二甲苯中浸没两次，每次15分钟；之后通过逐渐降低酒精浓度(100%, 95%, 80%, 70% and 50%)进行再水化，每次5分钟；最后，放在蒸馏水中冲洗10分钟并进行空气干燥。

将含有200nM（纳摩尔）每个菌种探针的20μL杂交液添加到两个临床样本中并按照之前所描述的进行杂交。

在阴暗处用60μL的4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI”；100μ克/毫升）进行额外染色10分钟。

在进行微观可视化操作之前，将玻片用10mL的水进行冲洗并进行空气干燥。

2.7 微观可视化在进行微观可视化操作之前将样本用1滴非荧光浸泡油进行处理并盖上盖玻片。

用徕卡DM LB2荧光显微镜和装有能够筛选Alexa Fluor分子的敏感滤光器的徕卡DFC 3000 相机捕捉图像。

滤波器不能监测到用来确认自发荧光缺失的探针，所有的图片都通过徕卡IM50图像管理器、图像处理以及带有1000倍放大功能的归档软件获取，对于多种用途相同区域的图像则是通过与滤波器每一部分相应的PNA探针以及重叠区来获取的。