PNA-FISH技术

医学科学设计与研究作业

姓名：王祥璞

学号：20166020268 班级：16届口腔基础医学

检测并定位牙周致病菌的创新型方法：PNA-FISH技术

Luzia Mendes 、Catarina Ferreira、 Miguel Goncalves Pinto 均毕业

于波尔图大学牙科学院的牙周部。

Rui Rocha、Andreia Sofia Azevedo 、Nuno Filipe Azevedo毕业于波尔

图大学工程院化学工程系的能源、生物科技、环境、工艺学实验室。

关键字

PNA-FISH技术（肽核酸-荧光原位杂交技术）、组织浸润、伴放线放线杆菌（Pg）、牙龈卟啉单胞菌(Aa)、牙周疾病

摘要

目的：我们的目的是通过应用FISH(荧光原位杂交技术)开发肽核酸（PNA）探针，用以检测龈下菌斑和牙龈组织中的伴放线放线杆菌以及牙龈卟啉单胞菌，并对其位置进行定位。

方法：针对每种微生物设计各自的PNA探针，优化之后的PNA-FISH方法

可以使得每种微生物和它们各自的探针（也就是PNA-FISH复合物）同时杂交。在对Pg和Aa代表菌株进行测试之后，PNA-FISH方法就可以用来对患有重度牙

周炎的患者收集的龈下菌斑和牙龈样本中的微生物进行监测。

结果：对于（Pg PNA1007和 Aa PNA235）两种探针而言最佳的杂交环境是59℃ 150分钟。Pg PNA1007探针和 Aa PNA235探针的特异性和敏感性分别都

达到了100%和99.9%。临床样本的结果表明PNA-FISH方法可以监测并区分位于龈下菌斑和牙周组织内混合微生物群中的目标细菌。

讨论：这项研究为监测并定位临床样本中的Pg和Aa细菌提供了一种新的高

精度的方法，并且仅需要短短的数小时。通过使用这种方法我们就可以观测微

生物菌落中的这些菌种在牙周袋内的空间分布，并且在活体牙龈组织中首次应

用了FISH（荧光原位杂交技术）技术。

1.介绍

牙周炎是由易感个体的龈下菌斑和宿主防御系统之间的失衡所导致的。过

去十年来有关牙周膜的研究都非常的重要，然而，因为多种微生物复杂的性质

以及进行体内研究的困难，有关科研和诊断目的方面的性质依然具有挑战性。

现代的分子生物学方法已经取代了传统的培养方式，并且提供了一些新的资源，这些资源不仅仅可以区分单一的微生物，还对所有具有潜在致病性的群体也具

有非常的重要作用。

在这种情况下，生物膜研究中FISH（荧光原位杂交技术）的应用得到了重视，因为它可以通过标记的DNA探针和细菌核糖体RNA进行杂交对微生物进行

原位鉴定。一些人已经通过使用这项技术在体内观测到了龈上、龈下牙龈生物

膜中牙周病原菌的空间分布，以及他们入侵宿主上皮细胞的能力。

然而，这项技术提供的附加价值有助于了解生物膜的三维结构以及它们和

宿主组织之间的关系，FISH过程中的一些限制强烈的影响了这种关系。比如低

细胞渗透、杂交亲和性以及靶向部位对DNA探针的可通过性。这些限制经常引

发靶向部位特异性和敏感性的缺失，并随之丢失很多重要的信息。

为了克服这些问题，核酸类似物，也被称为DNA模拟物，得到了发展。在1991年Nielsen等人首先发现了PNA（肽核酸），随后在90年代晚期应用于微生物检测。在这种DNA模拟物中，DNA带负电荷的磷酸糖骨架被一种中性的聚

酰胺主链所替代，这种聚酰胺主链由N-（2-氨基乙基）甘氨酸单元所组成。中

性PNA链和互补RNA链之间电荷斥力的缺乏会使得PNA/RNA更迅速、更强烈的

结合。结果表明，PNA探针相比同类的DNA探针能更快的提升对靶序列的可访

问性。并且，PNA分子的疏水性更利于细胞通过生物膜基质的渗透和扩散。PNA

的使用给传统的FISH技术带来了更强、更高的特异性和敏感度。

因此，首先我们的目标是发展高特异性、敏感度的PNA探针对牙周病原菌

进行原位检测，Pg和Aa是位于龈下菌斑的牙周相关致病菌中的两种细菌，这

些牙周相关致病菌也会机械性的入侵口腔上皮细胞。因此，这是针对本次调查

研究的合乎逻辑的选择。

2.材料和方法

2.1 目标菌种和培养的维持

8个牙龈卟啉单胞菌（Pg）过滤、临床分离、分类培养都是由Mike Curtis 和Koji Nakayama两位教授提供的。3个伴放线放线杆菌菌株（Aa）由Casey Chen教授所提供。所有的菌株（表2）都保存在添加了5%去纤维蛋白羊血的胰

酶大豆琼脂（TSA）中，并将其放在37℃的厌氧环境下进行培养，每5-7天在

新鲜的培养板上对聚集的菌落划线。

2.2 探针的发展

设计针对每个微生物的PNA探针，首先用免费可行的Primrose（樱草花）

程序区分出潜在有用的寡核苷酸和15个碱基对，Primrose（樱草花）程序和核糖体数据库项目II（RDP II ）的16S rRNA数据库是相连接的。序列的选择

是基于五个随机选择的菌株16S rRNA基因的比较。为了避免丢失测试的五个随机菌株的感兴趣部位的可能序列。其次，也为了更好的达到我们的目的，我们

通过应用一些标准挑选出最好的PNA-FISH探针。也就是说，目标微生物的检测数高一些并且非目标微生物的检测数低一些；探针的内部并没有自我互补的结构；两种探针拥有相似的预期的解链温度以及高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量。最后，所选的序列合成Pg和Aa PNA探针的末端，它们的末端通过一个双 AEEA连接

臂分别与Alexa Fluor（一种荧光标记试剂） 488和594相连接。

2.3 理论灵敏度、特异性以及亲合力评价

使用更新后的RDP II（核糖体数据库项目II）数据库对理论灵敏度和特异性进行评估，并通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的搜索进行确定，网

址是/BLAST/.靶向序列至少要拥有1200个碱基