DNA重组技术

Bioedit
Oligo T10 sequence
T10 Gene Bank 19
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③ 电泳技术(Gel Electrophoresis):
电泳的基本原理: 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极运动 的现象称为电泳。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等 都具有可电离的基团，它们在某个特定的pH值下可以 带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着 与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用了这种性质，使得待分离样品中由于各 种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的不同， 而产生不同的迁移率，从而达到对样品进行分离、鉴定 或提纯的目的。
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
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DNA重组相关技术
① 质粒；
② 工具酶； ③ 电泳技术；
④ PCR技术；
⑤ 分子杂交技术； ⑥ ………….
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① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（9395℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链 DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工 合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成 部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’ 端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’ 方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板 ，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成 了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产 生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使 两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍， PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循 环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达 106～107倍。 25
12. 重组DNA技术
内容： 1 DNA重组的概念及意义 2 DNA重组相关技术 3 DNA重组主要步骤 4 获得目的基因 5 DNA重组体的构建 6 重组体转化及鉴定
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DNA重组的概念及意义
DNA重组技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因 工程的核心技术。是指将外源目的基因片段通过 DNA连接酶的作用插入到质粒载体中的过程。该技 术包括了一系列的分子生物学操作步骤，利用了多 种相关技术。 DNA重组的起始过程本质上是一个酶促生化过程，DNA 片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进 行复制。
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重组体的构建
连接：即将外源目的基因片段通过DNA连接酶（催 化将两个核酸片段连接起来的酶，ligase）的作用 插入到质粒载体中。
• 经过酶切或其它修饰后使待插入的DNA片段与适 当的载体产生同源末端； • 将两者按一定比例混合以后，加入DNA连接酶； • 在适宜的反应条件下（适宜的温度和缓冲液等）， 就可以将目的DNA连接到相应的载体中去，形成 重组体（即可用于转化大肠杆菌）。
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感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试 剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能 容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent cell) 。 转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的 感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细 胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞， 通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
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琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖主要是由D－半乳糖及其衍生物连接而成的一种 线性多糖，不带电荷； 琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质。 琼脂糖凝胶电泳是以此为基质，在电场的作用下及 中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳 极迁ห้องสมุดไป่ตู้，由于核酸的大小不同即形成了不同的条带。 由于核酸片断的迁移率与其分子量的对数成反比，所以 通过与已知分子量的标准参照物比较就可得出未知 片断的大小。 琼脂糖凝胶主要用于核酸的电泳支持介质，特别是核酸 的纯化和检测分析。
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’ 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
重组克隆的筛选 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄 青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养， 加入抗生素后进行筛选带有异源DNA分子的受体细 胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生 素的培养基平板上将难以确认哪一个克隆含有转化 的质粒。
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’ ATC …… 3’、 TAG …… 5’。
5’…… GAT 3’…… CTA
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
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酶切 由于限制性内切酶可以切开双链DNA的特定序列，因 此，可以利用这一特性，将所需要的目的片断切下来， 用于与选定的载体重组。 • 利用相关的生物学软件或相应的网站预先选 择和设计合适的酶切位点； • 选择合适的酶； • 选用适宜的酶反应缓冲液及温度； • 利用电泳检测酶切结果。
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获得目的基因
获得需要的目的基因常用的方法： ① 直接从生物体中提取总DNA，构建DNA文库(gene library)，从中调用目的基因片段； ② 直接从生物体中提取总mRNA，以mRNA为模板，逆 转录酶的作用下，反转录合成互补的DNA片段，构 建成cDNA文库进行筛选； ③ 利用PCR特异性地扩增所需要的目的基因片段； ④ 酶切获得片断等等。
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载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起在寄主体内复 制与表达的质粒(运载工具)。 具备的条件： • 在受体细胞中可以独立复制：载体应具有能够在特定 宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的 外源片段的复制； • 并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位 点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构； • 易于筛选和鉴定：还具有易于筛选和检测的标记性基 因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型
Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
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第二类(II型)限制性内切酶
能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置 上切割双链，如EcoRI G‘AATT_C。由于这类限制性内 切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种 限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核 苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、 10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺 序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，这个 轴两边的序列为倒置重复序列，如HindIII, AAGCTT。
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聚合酶链式反应（PCR） 1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )： 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性 Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离的热稳定性 Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成为可能；1987年 Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实 用阶段。1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式 反应”而获得诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应（PCR） 变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单 链DNA 退火：部分引物与模板的单 链DNA的特定互补部位相 配对和结合 延伸：以目的基因为模板， 合成互补的新DNA链
3 重组DNA操作主要步骤 ① 获得目的基因； ② 与克隆载体连接，形成新的重 组DNA分子； ③ 用重组DNA分子转化受体细胞， 并能在受体细胞中复制和遗传； ④ 对转化子筛选和鉴定； ⑤ 对获得外源基因的细胞或生物 体通过培养，获得所需的遗传 性状或表达出所需要的产物。
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DNA重组技术促进了分子生物学迅速发展，给人类探索自身生 命的奥秘展示了光明的前景； 生命关键的基础在于蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸的相互作 用，生物大分子的结构与功能的联系正是生命“活”的本质 所在。凭借DNA重组技术人们可以克隆获得天然的或任意设 计的核酸序列，可以大量获得过去难以得到的生物体内极微 量的活性蛋白质、可以设计获得任意定点突变的基因和蛋白 质，这就为研究蛋白质与核酸的结构与功能、揭露生命的本 质提供了很有力的手段； 特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究； 结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成，各有一个单 链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键 可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 17
平末端：切割方式的另一种是在同一位置上切割双链， 产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：