人羊膜上皮细胞的干细胞特性_金玲
人羊膜上皮细胞的临床应用前景
人羊膜上皮细胞的临床应用前景
肖露;周晓华;王克;卫焱星;马燕琳;余艳红
【期刊名称】《现代妇产科进展》
【年(卷),期】2015(24)6
【摘要】人羊膜上皮细胞(h AECs)源于人胎盘和胎膜的羊膜,具有部分胚胎干细胞特性。
h AECs表达干细胞的标记物,在体外诱导条件下可分化为三个胚层的细胞:外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的心肌细胞、内胚层的肝脏细胞等。
h AECs无致瘤性和免疫原性。
h AECs取自废弃胎盘,分离培养简单,极具临床应用前景,成为细胞治疗和再生医学的有利工具。
【总页数】3页(P478-480)
【关键词】人羊膜上皮细胞;胎盘;干细胞;免疫
【作者】肖露;周晓华;王克;卫焱星;马燕琳;余艳红
【作者单位】南方医科大学南方医院妇产科;海南医学院附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2
【相关文献】
1.人羊膜上皮细胞移植修复尺经损伤的临床研究 [J], 夏剑;徐永丰;许永武;万爱国;丁健
2.人羊膜上皮细胞的临床前研究进展 [J], 田亚冰;刘如明;肖建辉
3.人羊膜上皮细胞在妇产科领域的研究、应用及发展 [J], 王璇;周超;张英姿
4.人羊膜上皮细胞在妇产科相关疾病中的应用及研究进展 [J], 王璐璐(综述);赖东梅(审校)
5.人羊膜上皮细胞移植修复尺神经损伤的临床研究 [J], 夏剑;徐永丰;许永武;万爱国;丁健
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羊膜细胞类型-①羊膜上皮细胞：源于胎盘羊膜组织,表达干细胞标志分子及相关基因
羊膜细胞类型-①羊膜上皮细胞：源于胎盘羊膜组织，表达干细胞标志分子及相关基因羊膜细胞类型-①羊膜上皮细胞：源于胎盘羊膜组织，表达干细胞标志分子及相关基因，但不表达端粒酶基因，具有非致瘤性，同种异体移植后不发生免疫排斥反应，同时还可分泌免疫抑制因子，防止移植后炎性反应的发生，因此可以看作是免疫赦免细胞。
②羊膜间充质细胞：源自胎盘羊膜组织，具有明显的可塑性及多向分化潜能，是一种成体干细胞。
学术术语来源——羊膜细胞可保护和修复缺血再灌注损伤小鼠脑组织细胞文章亮点：作者前期研究证实羊膜细胞在体内能明显促进脑内神经元的再生，本次实验进一步通过流式细胞仪检测发现，其在体外也能保护缺血再灌注损伤Balb/C小鼠脑细胞，并抑制脑细胞的坏死和凋亡同时促进脑细胞再生。
关键词：干细胞；移植；羊膜细胞；Balb/C小鼠；脑细胞；缺血再灌注；细胞周期；凋亡；坏死；广东省自然科学基金主题词：羊膜；再灌注损伤；细胞周期；流式细胞术摘要背景：羊膜细胞主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞组成，均具有多分化潜能，可转化为神经元，且还有合成、释放生物活性物质和神经营养因子的功能。
作者前期研究证实羊膜细胞移植入脑内后，能明显促进脑内神经元的再生。
目的：探索羊膜细胞对小鼠缺血再灌注损伤脑细胞的作用。
方法：将Balb/C小鼠通过夹闭双侧颈总动脉方法建立脑缺血再灌注损伤模型后，分离小鼠脑细胞。
取孕鼠新鲜胎盘，分离羊膜细胞。
将与羊膜细胞共培养的小鼠脑细胞作为实验组，以PBS培养的小鼠脑细胞作为对照组。
结果与结论：实验组小鼠脑细胞活性较对照组明显增加(P < 0.05)。
培养24，72 h后实验组小鼠脑细胞坏死率较对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，而培养48 h后实验组小鼠脑细胞坏死率较对照组明显降低(P < 0.05)。
实验组小鼠脑细胞中S期细胞数量增加，而对照组小鼠脑细胞中G1期细胞数量增加，S期细胞数量减少，但2组小鼠脑细胞中G2期细胞数量不变。
人羊膜间充质干细胞的生物学特征
人羊膜间充质干细胞的生物学特征1. 引言1.1 研究背景人羊膜间充质干细胞是一类重要的干细胞类型，具有广泛的临床应用前景。
研究人羊膜间充质干细胞的生物学特征是当前生物医学领域的热点之一。
通过对人羊膜间充质干细胞的深入研究，可以更好地了解其特性和潜在应用价值，为干细胞治疗和再生医学提供更多可能性。
人羊膜间充质干细胞来源广泛，易于获取，且具有较高的增殖活性和分化潜能。
这些特点使其成为一种理想的干细胞来源，可以用于治疗多种疾病和再生医学研究。
人羊膜间充质干细胞的免疫学特征较好，能够降低排斥反应的风险，为临床应用提供了有力支持。
1.2 研究意义人羊膜间充质干细胞的研究意义在于探索这一新型干细胞在临床应用中的潜力和机制。
人羊膜间充质干细胞具有广泛的多向分化潜能和免疫调节能力，因此可用于组织修复和再生医学领域。
研究人羊膜间充质干细胞的生物学特征，有助于深入了解其在不同疾病治疗中的作用机制，为开发新型干细胞治疗方案提供重要参考。
人羊膜间充质干细胞来源容易、获取成本低廉，具有较高的临床应用前景和潜力，可为医学研究和临床治疗提供新的思路和方法。
系统地研究人羊膜间充质干细胞的生物学特征，不仅有助于完善干细胞治疗技术，还能推动干细胞在临床应用中的更广泛应用，为促进医学进步和改善患者生活质量做出贡献。
2. 正文2.1 人羊膜间充质干细胞的来源人羊膜间充质干细胞的来源可以追溯到人羊膜组织。
人羊膜是胎儿在子宫内营养的一个重要器官，由外向内分别为羊膜皮层、羊膜绒毛层和羊膜上皮层。
羊膜上皮层中含有大量的间充质细胞，这些细胞具有一定的干细胞特性，具有自我更新、多潜能分化和抗衰老等特点。
人羊膜间充质干细胞的来源主要是通过孕妇在妊娠期间的羊水检查中获得。
一般来说，孕妇接受羊水穿刺检查时，抽取的羊水中会含有大量的羊膜间充质干细胞。
这些干细胞可以通过离心、培养和纯化等处理步骤，得到高纯度的人羊膜间充质干细胞，供科研和临床应用使用。
除了羊水检查外，人羊膜间充质干细胞还可以通过胎盘组织或胎盘血液等方式获得。
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
万方数据
万方数据
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
作者：丛姗， 宋瑾， 张惠娟， 李岩， 白立恒， 曹贵方， CONG Shan， SONG Jin， ZHANG Hui-Juan， LI Yan， BAI Li-Heng， CAO Gui-Fang
作者单位：丛姗,宋瑾,张惠娟,李岩,曹贵方,CONG Shan,SONG Jin,ZHANG Hui-Juan,LI Yan,CAO Gui-Fang(内蒙古农业大学兽医学院/动物组织胚胎学与发育生物学实验室,呼和浩特,010018)， 白立恒,BAI Li-Heng(内蒙古
妇幼保健医院妇产科,呼和浩特,010020)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2015,23(1)
引用本文格式：丛姗.宋瑾.张惠娟.李岩.白立恒.曹贵方.CONG Shan.SONG Jin.ZHANG Hui-Juan.LI Yan.BAI Li-Heng.CAO Gui-Fang 人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(1)。
人羊膜组织及羊膜干细胞的研究进展
胱、 脐膨 出和预防 腹部 、 颈部 和盆 腔手 术后 的粘 连 ， 面 骨及 软 骨 的缺损 ， 胎膜 早破 、 膜 突出部 位 的修 复 等 ， 脊 均取 得 良好 的效 果 。 目前 ， 通过 生物 工程 技术对 羊 膜 进行 生物 学 改 良 ， 使得 羊膜 的应 用有 了更 为广 阔 的前 景 。Ｔ ｄ ｏ ａ等 将 羊 膜制 备 成 “ 干 羊 膜 ” 与 冻存 新 超 ， 鲜羊 膜相 比 ， 处理更 方 便 ， 疗效 果更 好 。 治
生 物材 料 ， 的 主要 成 分 是 Ⅲ、 Ｖ型 胶原 蛋 白 、 它 Ⅳ、 蛋 白多糖 、 蛋 白及 整合 素 、 层体 ， 提供 一定 的力 学 糖 板 可
支持 并具 有一 定 的物理 强度 ， 是一 种极 为 特殊 的细 胞
外基 质 。
１９ ９ ７年 ， ｅ Ｔ ｅ ｇ等分 别 将 羊膜 用 于 临 床重 Ｌ ｅ及 ｓｎ
子 （ Ｇ ） 色 素 上 皮 衍 生 因 子 （ Ｅ Ｆ 等 ， 些 活 性 Ｋ Ｆ、 ＰＤ ） 这 因子 可促 进种植 细胞 的增 生 、 附 、 化 、 育 等多 种 黏 分 发
重要 的生 物学 功 能 。这 也 可 能正 是 羊 膜 移 植 后 能 够
只 眼恢 复 到 良好 水 平 ， ３只 眼 视 力 恢 复 较 差 。 Ｔａ ｓｉ 等 将 严重 眼表 疾病 患 者 健 眼 的 自体 角 膜 缘 干 细胞
用 含羊 膜 的胎膜 供体 移植 于烧 伤 和溃疡 创 面的报 道 ，
直 至今 日已相继 有 学 者 采用 羊 膜 修 复 人 工 阴道 及 膀
织 纤 维束构 成 ， 具有 一定 弹性 。
人 羊膜 细 胞 外 基 质 （ ｕ ｎ ａ ｉ ｉ ｅｔ ｃｌ ｌ ｈ ｍａ ｍｎｏ ｃ ｘ ａｅｌ ａ ｔ ｒ ｕｒ ｍａ ｉ， Ａ— Ｃ 是 指将 羊膜 经 过组 织 工 程 技 术 处 ｔｘ Ｈ ｒ Ｅ Ｍ） 理后 ， 去除其 细胞 和可 溶 性 蛋 白成 分 ， 只保 留原 有 组 织 中的不 可溶 性成 分 ， 主要是 保 留了基 膜 与致 密层 的
人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择
人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【摘要】背景：文献报道人羊膜间充质干细胞提取方法各不一致，得到的细胞数量各不相同。
目的：探索人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。
<br> 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别通过4个实验7种方法体外培养人羊膜间充质干细胞。
①实验一：分别采用3种方法：0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min；0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min；0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min。
②实验二：采用0.05 g/L的胰蛋白酶消化30 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min。
③实验三：分别采用2种方法：0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min；0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化40 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min。
④实验四：采用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min。
显微镜下观察其形态，研究人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。
<br> 结果与结论：用0.05 g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30 min，然后用1 g/L的胶原酶消化60 min是最合适的体外分离培养条件。
细胞成细长梭形或星形，胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。
说明实验四采用的胰酶和胶原酶消化的时间合适，而且胶原酶的浓度合适，得到的细胞数量最多。
%BACKGROUND:Extraction methods of human amniotic mesenchymal stem cells are inconsistent in the number of cells. <br> OBJECTIVE:To explore the optimal method to in vitro isolate and culture human amniotic mesenchymal stem cells. <br> METHODS:Under sterile conditions, ful-term cesarean fetal amniotic membrane was cut into pieces, then to isolate human amniotic mesenchymal stem cells by seven methods in four experiments. In experiment 1, human amniotic mesenchymal stem cells were isolated by the fol owing three methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 10 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.75 g/L col agenase I for 120 minutes;(3) co-digestion with 0.05 g/L trypsin and 0.75 g/L col agenase for 60 minutes. In experiment 2, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 30 minutes. In experiment 3, the samples were digested by two methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.05 g/L trypsin digestion for 40 minutes×2, fol owed by 0.75g/L col agenase digestion for 60 minutes. In experiment 4, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 1 g/L col agenase digestion for 60 minutes. Folowing morphology observation under a microscope, we studied the most suitable method for isolating human amniotic mesenchymal stem cells. <br> RESULTS AND CONCLUSION:Digestion with 0.05 g/L trypsin for 30 minutes twice fol owed by 1 g/L of col agenase digestion of 60 minutes was the most suitable isolation and culture condition in vitro. cells became elongated fusiform or star-shaped with rich cytoplasm, and nuclei were round with 1-3 nuts. We can harvest the most number of human amniotic mesenchymal stem cells using the method described in experiment 4.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P944-949)【关键词】干细胞;培养;间充质干细胞;羊膜间充质干细胞;细胞培养;胰蛋白酶;胶原酶;863项目【作者】张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【作者单位】内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction干细胞是一种能够自我更新且未分化的细胞，在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
人羊膜上皮细胞移植治疗肝纤维化现状与展望
人羊膜上皮细胞移植治疗肝纤维化现状与展望摘要：肝纤维化是慢性肝病发展到终末期肝病的必经阶段。
肝星状细胞的激活和增生是肝纤维化发生、发展的中心环节，而转化生长因子β是导致肝星状细胞激活最强的细胞因子。
因此，下调转化生长因子β的表达和抑制肝星状细胞的活化是防治肝纤维化形成的关键。
目前尚无有效方法抑制肝纤维化。
近期发现骨髓间充质细胞等肝干细胞能明显抑制转化生长因子β的表达，抑制肝星状细胞的活化。
因此，肝干细胞为肝纤维治疗提供了新方法。
由于致瘤性、伦理学及细胞来源限制，此类肝干细胞临床应用前景有限。
人羊膜上皮细胞源于胎盘，表达干细胞特性，并体外诱导向肝细胞分化，因易获得、数量大、非致瘤性和移植后免疫排斥反应轻，未来更有利于临床应用。
关键词：人羊膜上皮细胞肝纤维化肝细胞移植【中图分类号】r-0【文献标识码】b【文章编号】1671-8801（2013）02-0039-02我国是肝炎、肝硬化、肝癌高发国家，目前，我国慢性乙肝患者约为2000万人左右，其中近25%～30%可发展为肝硬化，而15%肝硬化患者可发展为失代偿期肝硬化。
有数据显示，代偿期肝硬化病人5年存活率为55%，失代偿期肝硬化病人5年存活率为14%。
研究证实，肝纤维化是发展到肝硬化必然经过的中间阶段，有效的抑制肝纤维化过程，人类攻克肝硬化这一世界性的难题奠定治疗基础。
目前尚无明确有效的方法抑制肝纤维化进程。
肝纤维化是慢性肝脏损伤的终末期表现，导致肝硬化、门脉高压、肝癌等严重的并发症，且没有特效药物治疗。
医学研究已经证明了肝星状细胞（hepatic stellate cells，hscs）的活化增殖在肝纤维化的发生发展中起着关键性的作用。
而hscs的增殖/凋亡与胶原合成/降解失衡则是肝纤维化形成的重要机制[1]。
肝脏受损时，激活hscs，活化后的hscs表达a-平滑肌肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-sma），其细胞增殖速度和胶原合成能力大大增强，同时产生过多的细胞外基质（extra cellular matrix，ecm），主要是胶原蛋白i和纤粘连蛋白，从而启动肝纤维化过程[2]。
羊膜在眼科临床中应用
分，可避免炎症细胞和细胞因子诱 发的角膜基质 细胞和胶原纤维的过度增生，从而抑制局部炎症， 促进表面愈合而不 留瘢痕 。
5个方面的临床效果
由以上5个方面的作用机制使临床达到： 加速上皮化 维持正常上皮表型， 减轻炎症反应， 减轻血管化 减少瘢痕形成等
硷性烧伤 硷能溶解脂肪和蛋白质，与组织接触后能很快渗透 扩散到组织深层和眼内，使细胞分解坏死。因此，硷性烧伤的 性质与结果要比酸性烧伤严重得多。
羊膜应用于眼科疾病-烧伤
化学烧伤、热烧伤等所引 起的严重OSD，对于双眼 结膜的大片瘢痕、睑球粘 连以及穹窿缩窄分离松解 后的创面修复，羊膜能提 供一个含基底膜和基质成 分的胶原支架，以使受体 及结膜或角膜表型的上皮 细胞扩展或移行其上，达 到重建眼表（结膜或角膜 上皮）的目的。
羊膜应用于眼科疾病-翼状胬肉
翼状胬肉又称“胬肉攀 睛”，是临床上最为常见 的眼科疾病之一，也是最 为古老的眼病之一，它是 局部球结膜纤维血管组织 呈三角形增生而侵犯角膜 的一种疾病，形似蝉翼， 故被称为“翼状胬肉”。 翼状胬肉不仅可以引起眼 部刺激症状、影响美观， 还会不同程度的影响视力
羊膜应用于眼科疾病-翼状胬肉
胞的分化 通过抗蛋白酶的活性，清除炎症细胞 能抑制转化因子的信号传递和抑制正常成纤维
细胞分化为肌成纤维细胞
羊膜在眼表重建中的作用
1. 基底膜为干细胞提供“肥沃的土壤”。 2. 其中各 种旦白成分能促进上皮分化，增生。 3. 增强旦白粘附性，在上皮创伤愈合中作用重大。 4. 羊膜含有的旦白酶抑制因子通过抑制旦白酶而发挥
发生免疫排斥反应。 羊膜细胞能分泌多种抗体，多种溶菌酶，裂解体
和补体，具有抗病毒和杀菌作用与唇粘膜，鼻粘 膜移植相比，移植后发生感染的风险较小。
人羊膜上皮细胞培养工艺的优化及生物学特性
人羊膜上皮细胞培养工艺的优化及生物学特性刘超;徐志国;王绍红;程红玲;杨旭巍;贡波;刘洋;徐春艳【摘要】背景:目前人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存的研究较为分散,难以形成全面有效的方案以满足未来对移植用干细胞的临床需求.目的:建立人羊膜上皮细胞优化的分离、培养与冻存工艺,并对其生物学特性进行研究.方法:运用正交法研究各因素对人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存指标的影响,极差法分析数据得到优化的分离、培养与冻存工艺条件.对人羊膜上皮细胞进行原代与传代培养,通过镜下形态学观察,绘制细胞生长曲线,进行流式细胞术检测、免疫荧光染色及向肝样细胞分化等实验,观察人羊膜上皮细胞的生物学特性.结果与结论:①获得优化的人羊膜上皮细胞分离条件为:胰酶浓度0.25%,分4次消化,每次消化时间20 min;优化培养条件为:细胞接种浓度为4×108 L-1,表皮生长因子质量浓度为10μg/L,血清体积分数为5%;优化冻存条件为:细胞冻存浓度为1×1010 L-1,二甲基亚砜浓度为10%,血清体积分数为80%;②原代细胞在接种二三天内贴壁生长,贴壁后细胞呈不规则多角形,以铺路石样生长,传代后细胞贴壁与生长速度加快,冻存复苏的传代第2代细胞生长与扩增能力无明显下降;③免疫荧光染色显示,原代人羊膜上皮细胞强表达CK19、SSEA-4,不表达Vimentin、CD45和HLA-DR;原代与传代第4代免疫表型检测显示,人羊膜上皮细胞在培养传代过程中有上皮间充质转化现象发生;④向肝样细胞分化实验中,免疫荧光染色显示,诱导后的人羊膜上皮细胞肝细胞标志物白蛋白、CK18表达量明显上升,糖原染色显示诱导3周后的人羊膜上皮细胞有糖原合成;⑤结果表明,人羊膜上皮细胞易于获得且体外增殖能力强,表达胚胎干细胞保持未分化状态的表面标志物.%BACKGROUND:As current studies on isolation, culture and cryopreservation of human amniotic epithelial cells (hAECs) are relatively scattered, it is difficult to form a comprehensive and effective solution tomeet the clinical needs of stem cells for transplantation infuture.OBJECTIVE:To establish the technology of isolation, culture and cryopreservation of hAECs, and to study the biological characteristics of hAECs.METHODS:Orthogonal method was used to study the effects of different factors on the separation, culture and cryopreservation, and range method was adopted to analyze the data to optimize the separation, culture and cryopreservation. We performed cell primary and passage cultures, morphology observed by microscope, drawn cell growth curve and flow cytometry assay, immunofluorescence staining, hepatocyte like cell differentiation to study the biological characteristics of hAECs.RESULTS AND CONCLUSION:(1) The optimal hAECs separation conditions were as follows:trypsin digestions were conducted at a concentration of 0.25%, four times, once for 20 minutes digestion; optimal conditions of culture were 4×108/L cell seeding density, 10 μg/L epidermal growth factor, 5% serum; optimal conditions of cryopreservation were 1×1010/L cell cryopreservation density, 10% dimethyl sulfoxide, 80% serum. (2) The primary cells were adhered to the wall in 2-3 days, exhibiting irregular polygon, paving stone-like growth. Cell adherence and growth rate were accelerated after subculture, and the growth and proliferation ability of passage 2 cells were not significantly decreased after cryopreservation and resuscitation. (3) Immunofluorescence staining showed that the primary cells strongly expressed SSEA-4 and CK19, but did not express Vimentin, CD45 and HLA-DR. The immunophenotype statistics of the primary and passage 4 cells showed the epithelial mesenchymal transition of hAECs inculture process. (4) Immunofluorescence staining showed that the liver cell marker expression of ALB, CK18 was significantly increased after hAECs were induced to differentiate into hepatocyte-like cells. Glycogen staining revealed glycogen synthesis in hAECs after 3 weeks of induction. To conclude, hAECs are easy to obtain and have strong proliferation ability in vitro, and express surface markers for undifferentiated embryonic stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)013【总页数】8页(P2100-2107)【关键词】干细胞;培养;人羊膜上皮细胞;正交法;生物学特性;冻存工艺【作者】刘超;徐志国;王绍红;程红玲;杨旭巍;贡波;刘洋;徐春艳【作者单位】浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction干细胞移植凭借其细胞来源丰富、不易感染、免疫原性低和并发症少等优点，已逐渐成为当今生物医学研究的热点。
体外诱导人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞
成瘤 的 困扰 ， 而骨 髓 基质 细 胞 要 跨胚 层 分 化 且 取 材
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时对机体损伤大 ， 对神经系统疾病的临床治疗也不 尽人 意 。近 年 来 研 究 证 明人 羊膜 上 皮 细 胞 （ｕ ａ ｈｍ ｎ
ａｎｏｃｅｉｅａ ｃｌ ，Ａ Ｃ ） 有 部 分 胚 胎 干 细 胞 ｍ ｉｉ ｐｔ ｌｌ ｅｓｈ Ｅ ｓ具 ｔ ｈ ｉ ｌ 特 性ｌ １可分 化 为 ３个胚 层不 同类 型 的细 胞 Ｌ ｊ 卜２， ０ ，
刘红敏 ， 陈旭 东 ， 华新 宇
（ 漯河医学高等专科学校 组织胚胎学教研室 ， 河南 漯河 ４ ２０ ） ５（ ２ ３ 摘要 ： 目的 探讨人羊膜 上皮 细胞体外 向神经样细胞诱导分化 的条件 。方法 碱性成纤 维细胞生长 因子预诱导
剂（Ｆ Ｆ ， ｂ Ｇ ）化学诱导剂全反式维甲酸 （ Ｔ Ａ）丁 酸羟基 茴香 醚 （ Ｈ 作 为诱导 剂 ， 以不含诱 导剂 的无 血清 的 ＭＥ ＡＲ 、 Ｂ ａ） 并 Ｍ 培养基作为对照 ， 密切观察分 化过程 中细胞形态 的变 化 ， 诱导至 ６ｈ １ 、４ｈ ， 用免疫细胞 化学方法检 测神经元 、２ｈ ２ 时 利 特异性标志物的表达情况 。结果 诱导分化 １ 后 的 Ａ Ｒ ２ｈ Ｔ Ａ组大部分细胞 呈现双极 、 多极 和锥形 的典 型神经元细胞 ｈＥ ｓ Ａ Ｃ 可以在体外诱导 分化为神经元 样细胞 ， 全反式 维甲 （ Ｔ Ａ Ａ Ｒ ）诱 导效 的形态 ， 免疫细胞 化学显示这些细胞表现为 Ｎ Ｅ染色 阳性 ， Ｓ 而丁酸羟基茴香 醚（ Ｈ ） 细胞形态没 明显变化 ， Ｂ Ａ组 两组都 不表达神经胶质细胞标记 物 Ｇ Ａ 。结论 ＦＰ
生物羊膜特点与应用
质量保证
瑞济羊膜理化性能检测： 外观：清洁、透明、无杂质、无破损 水份：水份＜ 10% 缝合拉力：应不小于1.0g，5分钟 酸碱度测定：羊膜浸出液与同批空白对
照液之间， PH值之差不超过1.5
瑞济冷冻干燥生物羊膜 --与新鲜羊膜的比较
生物羊膜组织的透射电镜检测
新鲜羊膜
冷冻干燥羊膜
冷冻干燥羊膜与新鲜羊膜的各层组织结构相同
但对于复发性胬肉或缺乏相对正常自体干细胞的患者，许多学者试用羊膜移
植治疗翼状胬肉，其术后复发率明显低于单纯切除组。这可能与羊膜本身没
有抗原性，不会诱发免疫反应；同时羊膜能抑制炎性反应，阻止新生血管长
入；羊膜有接触抑制，本身可以阻止变性结膜组织生长，防止胬肉复发。⑻
解决屈光手术引起的角膜混浊(Haze)。 多数人认为角膜混浊的产生与激光手术产生的局部炎症反应及新生上皮产生 的多种生长因子引起前基质细胞和胶原的异常增生有关，因此羊膜移植可以 减轻手术区域的炎症反应及局部刺激因素，有望减轻角膜混浊。 ⑼作为体 外细胞培养的载体：随着角膜缘干细胞理论与实验培养技术的发展羊膜作为 没有抗原性、有较好的生物相容性等，使其成为载体的最佳选择，但有关这 种上皮羊膜上培养后抗原性改变，移植上皮眼表的分化及功能的维持都需要 鸡长时间的探讨。
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好 的事情 马上就 会到来 ，一切 都是最 好的安 排。下 午10时2 分30秒 下午10 时2分2 2:02:3 020.10 .19
1.上皮层：羊膜上皮可为单层立方形、在胎儿面上皮为柱状，有时 上皮呈假复层，其上皮层内可见退化细胞。上皮细胞内常含有脂 肪滴。该层是新鲜的羊膜组织抗原性所在的部位。
2.基底膜层：由狭窄的无细胞网状纤维构成，厚度不一。在胎盘处 羊膜的基底膜最厚，该层组织PAS染色呈阳性反应。
人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究
酶 ， ３ ℃ 下 消 化 ４ ｈ 离 心 ， 加 入 含 体 积 分 数 为 在 ７ ， 再
１％ 胎 牛 血 清 的 Ｄ Ｍ Ｆ２培 养 液 ， 打 均 匀 ， １ ０ ＭＥ ／ １ 吹 以 ×
ｌ Ｌ接种 于直径 为 １ ｍ 的培养 皿 中 ， 体积 分 Ｏ 个／ ０ｅ 置 数 为 ５ Ｏ 、７ ％Ｃ ：３ ℃细胞培养 箱 内培养 ２ｈ后 轻轻将 未 贴 壁的细胞吸出 ， １ ０ 个／ 以 ×１ Ｌ密度再接种于新培养 瓶 中 ， 日换液 ， 隔 每天观 察细胞 的生长情况 。因羊膜 上 皮 细胞贴 壁较慢 ， 混杂 的问充质 细胞或成纤 维细胞 贴 壁较快 ， 这时吸出重新 培养的细胞（ 即差异黏附法获得 的细胞 ） ０ ９ ％以上是羊膜 上皮细胞 。
广东医学
２ １ ８月 第 ３ ０ ０年 ｌ卷第 ｌ ６期 Ｇｕ ｎ ｄ ｎ ｄｃｌ ｏ ｒＭ Ａ ｇ ０ ０， ｏ．３ ，Ｎ ．１ ａ ｇ ｏ ｇＭｅ ｉａ Ｊ ｕ ｎ ｕ．２ １ Ｖ １ ｌ ｏ ６
・
２０５ ・ ５
人 羊膜 上皮 细胞 的分 离 、 化 及 其 生 物 学 纯 特性 研 究 术
公 司 ）、 原 酶 Ⅱ（ 国 Ｓｇ ａ公 司 ） Ｄ ａｅ酶 （ 国 胶 美 ｉ ｍ 、 ｎｓ 美
Ｓｇ ａ ｉ 公司 ） 大 鼠抗人细胞 角蛋 白 Ｃ ７ Ｃ ８ Ｃ １ ｍ 、 Ｋ 、 Ｋ 、 Ｋ ８单 克隆抗体 （ 国 ｂｏ ｏｌ 公 司） 美 ｉ ｒ ｗ ｄ 。
１ ２ 方 法 ．
３ ￣ 含体积 分数 为 ５ Ｃ 的 细胞 培养 箱 中静 置 培 ７Ｃ、 ％ Ｏ
金玲 ，陈剑 ，吴静 徐 锦 堂 ， ，周 清 ，刘 小勇 ，赵松 滨
， 东 省 深 圳 市 宝安 区人 民 医 院 眼科 （ １ １ １ ； 南大 学 附 属 第 一 医 院 眼 科 （ 州 ５０ ３ ） 暨 南大 学 医 学院 眼 广 ５ ８ ０ ） ２暨 广 １６０ ； 科研 究室（ 州 ５０３ ） 广 １６ ０
生物羊膜特点与应用
但对于复发性胬肉或缺乏相对正常自体干细胞的患者，许多学者试用羊膜移
植治疗翼状胬肉，其术后复发率明显低于单纯切除组。这可能与羊膜本身没
有抗原性，不会诱发免疫反应；同时羊膜能抑制炎性反应，阻止新生血管长
入；羊膜有接触抑制，本身可以阻止变性结膜组织生长，防止胬肉复发。⑻
2.基底膜层：由狭窄的无细胞网状纤维构成，厚度不一。在胎盘处 羊膜的基底膜最厚，该层组织PAS染色呈阳性反应。
羊膜的组织结构
3.致密层：薄而致密，是羊膜张力所在。此层与基底膜紧密相连，而与 下面的纤维母细胞层连接较松。该层由网织纤维组成，HE染色呈淡伊 红色均质带。致密层极少因炎症等原因引起水肿、增厚。在羊膜眼表 移植后此层的结构能阻止炎症细胞穿透羊膜向病灶区浸润。
生物羊膜特点与应用
羊膜-理想的眼科生物材料
自Davis(1910)首先利用羊膜作为生物敷料替代皮肤帮助 烧伤创面修复以来，羊膜作为一种来源方便、取材容易 和价格便宜等诸多优点的生物膜在临床上应用越来越广， 如覆盖烧伤的创面；修补阴道缺损；四肢溃疡；脾破裂 的修补和肾、胰移植时的包裹材料等等。
Rotth(1940)首次应用新鲜羊膜移植到睑球粘连的患者， 开创了羊膜在眼科临床应用的先例，其后有少量的文献 报道。
减轻角膜炎性反应，促进角膜上皮化，恢复正常的角膜上皮表型。 研究证明： 羊膜移植可以有效的治疗持续性角膜上皮缺损，单纯羊膜移植可以治疗角膜缘 干细胞的部分失代偿，并提高干细胞的移植成功率。但羊膜促进上皮化的机制 尚不清楚，可能与羊膜中含有促上皮生长因子。另外移植的羊膜可以作为干细 胞的载体，加速上皮的移行。
人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究
高 艳 崔 晓惠
摘 要 目的 ： 用 形 态 学 研 究 方 法 ， 利 探讨 神 经 干 细 胞 特 异 性 标 志 蛋 白 的 表达 和增 殖 分 化 特 性 ， 定 人 类 羊 膜 组 织 中 鉴
神 经 干／ 体 细 胞 的存 在 。方 法 ： 前 利用 免疫 组 织 化 学 法 ， 测 人 类 羊 膜 组 织 和培 养 人 类 羊 膜 细 胞 中 ｎ ｓｎ ｍ ｓｓｉ１ 检 ｅｔ 、 ｕａｈ一 、 ｉ ｖ ｅｔ ｉ ｎｉ ｍ ｎ和 Ｐ Ａ Ｎ Ａ 等 神经 干 细 胞 特 异性 标 志 蛋 白的 表 达 ，利 用 Ｂｄ Ｓ—ＣＭ ｒＵ掺 人 实 验 鉴 定 羊 膜 组 织 来 源 神 经 干／ 体 前 细 胞 的 增殖 分化 能 力 。结 果 ： 疫 组 织 化 学 检 测 证 实 人羊 膜 组 织 表 达 ｎ ｓｎ ｍ ｓｓｉｌＣ １３和 ｖｍ ｎｉ 免 ｅｔ 、 ｕａｈ— 、 Ｄ ３ ｉ ｉｅｔ ｎ等神 经 干
Ｖｍｅｔ ｉ ｎｉ 达 阳性 细胞 ，Ｂ ｄ ｎ表 ｒＵ掺 入 的组 织 形 态 学 结 果 不 仅 证 实 羊 膜 细 胞 中 Ｎ ｓｎ Ｍｕａｈ一 、 ｉ ｎｉ 性 细 胞 具 ｅｔ 、 ｓｓｉ１Ｖｍｅｔ ｉ ｎ阳
有 增 殖 活 性 ， 且 其 中存 在 已 分化 的神 经 元 和胶 质 细 胞 ， 示 羊 膜 组 织 细 胞 内存 在 神 经 干 ／ 体 细 胞 。 而 提 前
ｄｆ ｒ ｎ ｉｔ ｎ ｏ ｈ ａ ｉ ｔ ｃ ｉ ｂ ｔ ｉｉ ｇ ｔ ｅ ｉ ｅ ｅ ｔ ｉ ｆ ｔ ｅ ｍｎ ｏｉ ｅｌ ｙ ｕ ｉ ｚｎ ｈ ｍｏ ｐ ｏ ｏ ｙ ａｏ ｃ ｓ ｌ ｒ ｈ ｌ ｇ ｍｅｈ ｄ ，ｉ ｅ ｔ ｙ ｎ ｈ ｅ ｒ ｌ ｓｅ ｐ ｅ ｕ ｓ ｒ ｃ ｉｓ ｔ ｏ ｓ ｄ ｎ ｉ ｉｇ ｔ ｅ ｎ ｕ ａ ｔｍ／ ｒ ｃ ｒｏ ｅｌ ｆ
生物羊膜特点与应用
取 羊 膜 第 二 步（复检）
已跟踪孕妇在产前再次检测， 在其知情的情况下，剖腹产 后取羊膜
取 羊 膜 第 三 步（核实）
确认被采集的产妇在第三 个月及产前各检测结果均 是阴性后，再将羊膜进行 加工制备。
质量保证
辐照灭菌技术
国家药监局对辐照灭菌中针对HIV、HBV、HCV、 梅毒等病毒杀灭的有效性进行了反复放射学与 病毒学专家论证，确认了钴６０辐照生物羊膜 可以达到高水平的病毒安全性。
作为球结膜的替代物，人羊膜基底膜的Ⅳ型胶原结构同球结膜极其相似，这就 可能是羊膜移植在眼表重建中成功的原因。羊膜移植能提供一个健康的基质及 基底膜，便于结膜的上皮细胞分化、增殖并移行，达到重建结膜表面的效果。 羊膜具有促进结膜非杯状细胞和杯状细胞的增殖，抑制其创面的纤维细胞增生 和新生血管形成及促进炎症细胞凋亡等生物学效应。
减轻角膜炎性反应，促进角膜上皮化，恢复正常的角膜上皮表型。 研究证明： 羊膜移植可以有效的治疗持续性角膜上皮缺损，单纯羊膜移植可以治疗角膜缘 干细胞的部分失代偿，并提高干细胞的移植成功率。但羊膜促进上皮化的机制 尚不清楚，可能与羊膜中含有促上皮生长因子。另外移植的羊膜可以作为干细 胞的载体，加速上皮的移行。
但对于复发性胬肉或缺乏相对正常自体干细胞的患者，许多学者试用羊膜移
植治疗翼状胬肉，其术后复发率明显低于单纯切除组。这可能与羊膜本身没
有抗原性，不会诱发免疫反应；同时羊膜能抑制炎性反应，阻止新生血管长
入；羊膜有接触抑制，本身可以阻止变性结膜组织生长，防止胬肉复发。⑻
解决屈光手术引起的角膜混浊(Haze)。 多数人认为角膜混浊的产生与激光手术产生的局部炎症反应及新生上皮产生 的多种生长因子引起前基质细胞和胶原的异常增生有关，因此羊膜移植可以 减轻手术区域的炎症反应及局部刺激因素，有望减轻角膜混浊。 ⑼作为体 外细胞培养的载体：随着角膜缘干细胞理论与实验培养技术的发展羊膜作为 没有抗原性、有较好的生物相容性等，使其成为载体的最佳选择，但有关这 种上皮羊膜上培养后抗原性改变，移植上皮眼表的分化及功能的维持都需要 鸡长时间的探讨。
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中国组织工程研究与临床康复第 15 卷 第 19 期 2011–05–07 出版May 7, 2011 Vol.15, No.19Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research人羊膜上皮细胞的干细胞特性***☆金 玲1，陈 剑2，吴 静3，徐锦堂3，周 清2，刘小勇2Stem cell characteristics of human amniotic epithelial cellsJin Ling1, Chen Jian2, Wu Jing3, Xu Jin-tang3, Zhou Qing2, Liu Xiao-yong2AbstractBACKGROUND: Studies have found that human amniotic epithelial cells (hAECs) have a multiple differentiation capacity similar as pluripotent stem cells or embryonic stem cells. It is indicated that hAECs may be a new kinds of seed cells in tissue engineering reconstruction in the further. OBJECTIVE: To culture the hAECs in vitro and to investigate stem cell characteristics of cultured hAECs. METHODS: The human amniotic tissue was delivered from full term caesarean, and the highly purified hAECs were obtained from enzyme digestion method and differently sticky method. The hAECs were seeded in DMEM/F12 medium obtaining 10% fetal bovine serum for the first time and serial subcultivation. The immunofluorescence and flow cytometry were used to detect the expression of OCT-4 of stem cell factor and Stem cell surface molecule marker CD29, CD34, CD44, CD45, CD105 in passaged hAECs. RESULTS AND CONCLUSION: The cells in vitro looked like slabstone that epithelial cells specified. The results of immunofluorescence showed the expression of OCT-4 of stem cell factor in hAECs was positive. Detection of stem cell surface molecule marker by the flow cytometry showed the expression of CD29, CD34 on hAECs were positive, and the expression of CD44, CD45, CD105 on hAECs were negative. The findings show that the hAECs have some characteristics of embryonic stem cells, and may be a new kind of seed cells for the future tissue engineering reconstitution. Jin L, Chen J, Wu J, Xu JT, Zhou Q, Liu XY. Stem cell characteristics of human amniotic epithelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(19): 3555-3558. [ ]People’s Hospital of Baoan District, Shenzhen 518101, Guangdong Province, 2 China; Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 3 Research Room of Ophthalmology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China Jin Ling☆, Doctor, Attending physician, People’s Hospital of Baoan District, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China Jlingx2003@ Correspondence to: Chen Jian, Doctor, Professor, Chief physician, Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China Drchenj@ Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30872808*; Guangdong Key Science and Technology Planning Foundation, No. 2003A3020104*; Key Subject Foundation of Overseas Chinese Affairs Office of the State Council, No. 51205004 * Received: 2010-12-15 Accepted: 2011-04-011摘要背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能，说明其可能是未来组织工程重建的一 种新型种子细胞。
目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。
方法：取足月剖宫产的人羊膜组织，经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞，接种于含体积分数为 10%胎 牛血清的 DMEM/F12 培养基中进行原代和传代培养，用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细 胞的表面标记蛋白 OCT-4 和干细胞表面分子标记 CD29、CD34、CD44、CD45、CD105 的表达。
结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观，其胞浆中有 OCT-4 免疫荧光表达，其干 细胞标记分子 CD29、CD34 的表达是阳性，但干细胞标记分子 CD44、CD45、CD105 的表达为阴性。
结果表明人羊膜上 皮细胞具有干细胞的某些特性，其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。
关键词：人羊膜上皮细胞；细胞培养；胚胎干细胞；OCT-4；CD29；CD34 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.19.032 金玲，陈剑，吴静，徐锦堂，周清，刘小勇. 人羊膜上皮细胞的干细胞特性[J].中国组织工程研究与临床康复，2011， 15(19):3555-3558. [ ]察实验。
0 引言 羊膜是胎盘最内层的透明组织，其来源广 泛，取材方便。
最近有研究报道人羊膜上皮细 胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)拥 有仅表达于胚胎干细胞的表面标记蛋白，也具 有类似胚胎干细胞的分化能力，说明其可能是 未来组织工程重建的一种新型种子细胞。
实验 取足月胎儿羊膜的hAECs进行体外培养，从分 子水平探讨hAECs的干细胞特性。
1 材料和方法 设计：细胞学水平，分子学水平，体外观试剂 DMEM/F12 培养基、 优质胎牛血清 谷氨酰胺、青霉素、链霉素、 胶原酶Ⅱ、Dnase 酶 胰蛋白酶 兔抗人 OCT-4 多克隆抗体 美国 Hyclone 公司 美国 bioworld 公司时间及地点：实验于2008-09/2009-03在 暨南大学医学院眼科研究室完成。
材料：实验所取得的人羊膜组织均来自暨 南大学附属第一医院产科行剖宫产的健康孕 妇，经HIV、甲肝、乙肝、衣原体、梅毒等血清 学检查均为阴性，产妇知情同意，实验经医院 医学伦理委员会批准同意。
试剂：来源 美国 Gibco 公司 美国 Sigma 公司ISSN 1673-8225CN 21-1539/RCODEN: ZLKHAH35551金玲，等. 人羊膜上皮细胞的干细胞特性深圳市宝安区人 民医院， 广东省深 圳 市 518101 ； 2 暨南大学附属第 一医院眼科， 广东 省 广 州 市 3 510630； 暨南大 学医学院眼科研 究室， 广东省广州 市 510630 金玲☆， 1976 女， 年生， 湖北省十堰 市人， 汉族， 2009 年暨南大学第一 临床学院眼科学 专业毕业，博士， 主治医师， 主要从 事角膜病、 角膜移 植的临床和基础 研究。
Jlingx2003@ 通讯作者：陈剑， 博士，教授，主任 医师， 暨南大学附 属第一医院眼科， 广东省广州市 510630 Drchenj@163. com中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)19-03555-04 收稿日期： 2010-12-15 修回日期： 2011-04-01 (20101215023/M·W)方法：hAECs的原代和传代培养：将羊膜置于含有hAECs更容易分离为单个细胞， 细胞活性良好， 呈圆形、透亮、折光性较强、富有立体感。