转基因动物与生物反应器

组的重排、易位、缺失或
定点突变。
显微注射转基因技术
源自文库
• DNA显微注射法经典的技术路线
目的基因 显微注射
已交配的 供体动物 取出 受精卵 移植 受体动物 输卵管 妊娠 转基
显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入 方法。 缺点：整合效率低（小于1%）；不能定点整合；方法复杂、 设备昂贵。
结构，与细胞膜类似，因
此可以与受体细胞膜融合，
从而将外源DNA转入宿
主细胞。这种方法转基因 效率高。
脂质载体包埋法
逆转录病毒法
原理： 逆转录病毒的核酸为一条单链RNA分子，其基 因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复 制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒 的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建 成重组载DNA。 另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之 整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒 包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组蛋白颗 粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。
转基因动物 概念：
将特定的目的基因从某一生物体分离
出来，进行扩增和加工，再导入另一
动物的生殖细胞或早期胚胎细胞中， 使其整合到宿主动物的染色体上，在 动物的发育过程中表达，并通过生殖 细胞传给后代。这种在基因组中稳定
整合有人工导入外源基因的动物称为
转基因动物。
• 代表性事件
• 1982年，帕尔米特等人将大鼠的生长激素 基因导入小鼠受精卵内，获得了比普通对 照小鼠生长速度快2-4倍，体形大以北的转 基因“硕鼠”。
转基因动物与生物反应器
基因工程技术 基因工程的概念
○基因工程是一种DNA重组技术,在分子水平 上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提 取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重 组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞 中表达获得新的遗传性状 ○基因工程的操作程序：获取目的基因—— 目的基因与载体构建重组DNA分子——重组DNA 分子转移至受体细胞——转化细胞的扩增、鉴 定和筛选
显微注射法的基本程序
通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠
血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠
便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个；
与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出
受精卵；
将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄
性原核内 ；
• 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠 体内； • 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； • 从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转 基因的整合与否及位点； • 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否 遗传及表达。
转基因动物技术的主要步骤：
外源目的基因的制备
外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞
选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定
筛选所得的转基因动物品系
第一节
目的基因的制备及转移
一、目的基因的来源
1. 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 2. 通过mRNA合成cDNA； 3. 人工合成的DNA片段；
利用脉冲电场提高细胞膜的
通透性，从而使外源DNA
转移至细胞中。此法简单、
效率较高，广泛应用于培养
细胞的基因转移。
电穿孔法实现外源基因的转移
利用显微操作技术转移外
源基因的方法。此法转入 基因长度可达数百kb；并 能随机地整合在受体细胞 染色体DNA上，因此应用 范围广。但是这种整合有 时会导致转基因动物基因
通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图
用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强， 即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转
4. 聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。
二、目的基因的克隆
• 通过载体在适当的宿主中克隆
选择载体
目的基因与载体的连接
重组体导入受体细胞
• 通过PCR反应克隆目的基因
三、转基因技术--目的基因的转移
电穿孔法 显微注射法 裸露DNA直接注射 磷酸钙—DNA共沉淀法 脂质载体包埋法 病毒介导的生物学方法
东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪 绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆
转基因动物实例三
转绿色荧光蛋白的兔
转基因动物实例四
正在进行转基因山羊的实验
乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊
上海交通大学医学遗传研究所
just a joke
•反转录病毒法 •基因显微注射法
•胚胎干细胞移植法
步骤： 1.逆转录病毒载体的构建 2.选择和培养包装细胞系 3.重组病毒DNA导入包装细胞 4.收集重组病毒颗粒 5.感染胚细胞，使细胞转化 此法是目前制备转基因鸡最有效和 最成功的方法。
病毒介导的生物学方法
第二节
转基因动物的方法
转基因动物实例一
超级奶牛－普通奶牛的三倍大 （英国）
转基因动物实例二
一、雄原核显微注射法
以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构 建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接 受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得 转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。
这一方法的实验程序如下： • ⑴载体DNA制备 ａ受精卵准备 • ⑵胚胎操作过程 ｂ显微注射 ｃ假孕母鼠准备(养母) ｄ胚胎移植 • ⑶对幼鼠鉴定
历史事件
1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将 大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因） 和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性 基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出 两种抗性的细菌。 1974年 科恩将非洲爪蟾编码核糖体的基因 同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠 杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细 菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。
这种方法是受二价金属离
子能促进细胞吸收外源 当核酸以磷酸钙—DNA共 沉淀物的形式在时，细胞 但转移效率较低，仅有 1%~5%的外源DNA可以
DNA的启发而发展起来的。
摄取DNA的能力显著加强。
进入受体细胞核中，大约
仅有1%的DNA可以在细 胞中稳定表达。 磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术
将需要转移的外源DNA 或RNA包裹于脂质体内， 由于脂质体具有磷脂双层