酶学实验技术

原因：
酶反应几乎都在水溶液中进行，自然简便 缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且 会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量； 另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。
固定化酶的优点：
①可多次使用，酶的稳定性提高。 ②酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高；
③反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法
E
E E E
E
E E E
E E E
E E
E E
E
E 吸附法
E
E
共价结合法
交联法
包埋法
（1）载体结合法
①物理吸附法：
载体：无机载体、天然高分子、大孔型合成树脂、
疏水型的载体。 缺点：酶与载体之间的结合力不强，酶易于脱落， 导致酶活力下降并污染产物。
1961年按酶所催化的反应类型将酶分成6大类：
①氧化还原酶类；
②转移酶类；
③ 水解酶类；
④裂合酶类； ⑤异构酶类； ⑥合成酶（或称连接酶）类。
二、酶学实验技术简介
①酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的 应用开发； ②酶和细胞的固定化及酶反应器的研究 （包括酶传感器、反应检测等）； ③酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶 （突变酶）的研究；
（3）酶学特性的变化
底物专一性、 最适pH、 最适温度、 米氏常数 最大反应速度等，均可能发生变化。
填充床反应器
第五节 酶在医药工业中的应用
一、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 技术路线
培养 明胶包埋-戊二醛交联 E.coli 斜面 细胞 固定化细胞（颗粒状） 填充床式反应器
青霉素G
转化液
过滤
甚至酶的专一性等性质也会发生变化。
（2）交联法
原理：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物
的细胞与细胞之间交联的固定化方法。
常用的交联剂有戊二醛等。
缺点：反应条件强烈，固定化酶的酶活较低； 优点：酶的稳定性提高。
交联方式
最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分 子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联： —CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CHN CH (CH2)3 N CH (CH2)3
二、酶的生产菌
1、对菌种的要求：
（1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶； （2）不是致病菌； （3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
2、生产菌的来源：
菌种保藏机构和有关研究部门，
从自然界中分离筛选——菌样采集、菌种分离初
筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。
CH
N
CH
N
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶-N=CH-
交联法
常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶 （蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；
常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如
牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。
（3）包埋法
网格型、微囊型
网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等 合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然
④有机相中酶反应的研究；
二、酶学实验技术简介
⑤酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究； ⑥抗体酶、核酸酶的研究； ⑦模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研
究。
第二节 酶的来源和生产
一、酶的来源：主要是动植物和微生物
利用微生物生产酶的优点是： ①微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都 可从微生物中得到； ②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过 控制培养条件来提高酶的产量； ③微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段， 能培育出新的高产菌株。
改良（如基因突变、基因转移和基因克ห้องสมุดไป่ตู้）。
3、目前常用的产酶微生物：
大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、
木霉菌、根霉菌、链霉菌等。
三 酶的制备
（一） 生物提取
蛋白质提取，采用保持活性的分离法
大致步骤： 细胞破碎→离心分离→硫酸铵盐析→透析 →凝胶过滤→离子交换→冷冻干燥
1、比活力： 单位质量酶产品中酶活力称比活力。
高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的
方法。
2、固定化酶的性质
（1）酶活力的变化
一般酶活力下降，可在固定化反应体系中加入 抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。
（2）酶稳定性的变化
①操作稳定性，半衰期在1个月以上，可以认为
其具有一定的工业应用价值；
②贮藏稳定性； ③对蛋白酶的稳定性。 ④热稳定性
④酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少； ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。
一、固定化酶的制备
1、固定化所采用的酶：
经提取分离后得到的有一定纯度的酶，
结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。 2、酶和细胞的固定化方法
载体结合法、包埋法及交联法
酶和细胞的固定化方法
载体结合法 交联法 包埋法
（1）载体结合法
②离子结合法：
载体：多糖类离子交换剂和离子交换树脂， 如DEAE-纤维素等。 缺点：结合力也比较弱，酶易脱落
（1）载体结合法
③共价结合法：
原理：酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、 巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固 定在载体上。 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落。 缺点：反应条件剧烈，往往不能得到比活性高的固定化酶，
比活力= 总蛋白mg数
总活力单位
= U(或IU) mg蛋白
2、纯化倍数：指提纯后与提纯前酶比活力
的比值。
（二）利用DNA重组技术改造和生产酶
外源酶基因 重组入
工程菌
酶产品
优点：不受天然来源限制，迅速，且易于诱变改造
第三节 酶和细胞的固定化
酶 溶液 状态 载体（海藻酸钙、琼脂、 卡拉胶、壳聚糖） 固定化（吸附、共价 结合、交联、包埋）
酶学实验技术
第一节 概述 第二节 酶的来源和生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 酶的应用
第一节 概述
一、酶的特性 酶：有催化能力的蛋白质
酶促反应（酶催化反应）
酶催化反应的特点：
一般特点：①能加快反应速度；②降低反应活化 能；③不改变反应的平衡点；④反应前后数量和 性质不变 独特特点：①催化效率高；②专一性强；③反应 条件温和；④酶的催化活性受到调节和控制。
滤液
抽提
6-APA
二、固定化酶法生产L-氨基酸
营养、药物、增味剂等；
技术路线
DL-氨基酸
乙酰化
N-乙酰-DL-氨基酸 氨基酰化酶 消旋 水解 N-乙酰-D-氨基酸 L-氨基酸
氨基酰化酶：离子交换法，DEAE-葡聚糖载体， 填充床反应器