生物制药技术第三动物细胞工程制药(,,)剖析

(2)包埋和微囊培养
O 该培养方法与微载体的不同之处在于细胞不是贴附 在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊 内。有时包埋在凝胶或微囊内。有时包埋的凝胶载 体较大，故又被称为巨载体（macrocarrier）培养。 包埋发早起主要用于固定细菌、酵母等，被广泛地 用于工业生产和环境保护中，近些年才被移植于动 植物细 胞的培养。微培养是由包埋培养衍生而来， 即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊。它是从 1967年加籍华人张明瑞制备"人工细胞"中获得的启迪， 1979年Lim和Moss首次应用该法培养 哨乳动物细胞。
一、动物细胞大规模培养的方法
O 从生产实际看，动物细胞的大规 模培养主要可分为悬浮培养、贴 壁培养和贴壁-悬浮培养。
O1. 悬浮培养 O 顾名思义，所谓悬浮培养
(suspension culture )即让细胞自 由地悬浮于培养基内生长增殖。
O 它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞)， 也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优点是操作 简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易 扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可 借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细 胞体积较小，较难采用灌流培养(perfused culture)， 因此细胞密度一般较低。目前在生产中用于悬浮培 养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式 生物反应器。如英国的Wellcome公司采用8000 L 的搅拌罐式生物反应器培养Namalwa细胞大量生产 α-干扰素。英国的Celltech公司则用2000 L的气升 式生物反应器大量培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
3. 贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
O 如上所述，悬浮培养和贴壁培养 都有一定的优点和不足，那么能 否将二者结合，优势互补，形成 一种更理想的、更适于工业化大 规模生产的培养方法呢?下面将 介绍几种主要的二者结合的培养 方法。
(1) 微载体培养(microcarrier culture)
O 1967年荷兰的van Wezel首先采用葡聚 糖Sephadex A50微小颗粒培养贴壁细 胞成功，由此开创了微载体细胞培养 新纪元。该法的优点是它既可创造相 当大的贴附面积供细胞贴附生长繁殖， 满足了绝大多数细胞的基本要求，又 由于载体的体积很小，比重较轻，在 轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮 在培养基内，充分发挥了悬浮培养的 一切优点。
O ⑤粒径在60~250μm(溶胀后)之间为好，并 要 尽可能地均一，差异不大于20μm。这样有利 于细胞均匀地分பைடு நூலகம்在各微裁体表面。
O ⑥具有良 好的光学透明性，适于在倒置显微 镜下观察细胞在载体仁的生长情况。
O ⑦基质的性质最好是软 性的，避免在搅拌中 由于载体互相摩擦而损伤细胞。
O ⑧可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌。 O ⑨经简单的适当处理后，可反复使用。 O ⑩原料充分，制作简便，价廉。
O 后又经过多人的努力，到20世纪80 年代这种方法已被正式用于工业化 生产各种疫苗和其他细胞产品，并 出现了-大批商品化 的微载体(表3 9)。我国的军事医学科学院、华东 理工大学和中国科学院化工冶金研 究所等单 位也先后制备成功一批葡 聚糖类(MC-l型、CT-l型、CT3型)、 聚苯乙烯类(SH-2型、PS-l型) 和胶 原类(GT-2型)等微载体，用于生产 干扰素、疫苗和尿激酶原等产品。
2. 贴壁培养
O 贴壁培养(anchorage-dependent culture)是必须让 细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适 用于一切贴附依赖性细胞(贴壁细胞)，也适用于兼 性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正好相反， 优点是适用的细胞种类广(因为生产中所使用的细 胞绝大多数是贴壁细胞)， 较容易采用灌流培养的 方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦， 需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易 均一，传质和传氧较差，这些不足常常成为扩大培 养的"瓶颈"。
O 20世纪80年代中后期，人们在原来的固体微载体 (solid microcarrier)的基础上，又开发出 了被称为第 二代的多孔微载体(porous microcarrier)或多孔微球， 它的特点是极大地增大了供细 胞贴附的比表面积(如 Biosilon聚苯乙烯微载体的比表面积为225 cm2/g， Cytodex-l葡聚糖微载 体为6 000 cm2/g，而多孔微载 体Cytoporc的比表面积则高达2.8m2/g)，而且它同时 还适用于悬浮细胞的培养。目前也已有多种商品问世 (表3 -10)。它可分为两类:一类在载体内加入铁 等金 属，使比重增加，适用于流化床反应器;另一类不加 钛，比重轻，可与国体微载体一样，用于搅拌罐式生 物反应器或气升式生物反应器。前一种载体已在美国 Genetech公司用以大规模生产 t-PA，后一种已在中 国用于尿激酶原的中试生产。
O 生产疫苗中早期一般多采用转瓶大量 培养原代鸡胚或肾细胞。近代有些生 物制品的生产仍在采用这种方法，为 减少劳动强度，采用了计算机自动控 制的方法。另一种被普遍采用的贴壁 培养方法是固定床式生物反应器，但 由于该反应器中传质和传氧常会出现 梯度式不均一现象，故放大常受到限 制。
O 贴壁培养与悬浮培养的另一个不同之 处是在传代或扩太培养时常常需要用 酶将其从基质上消化下来，分离成单 个细胞后再进行培养。
理想的微载体需具备如下一些条件:
O ①微载体表面性质与细胞有良好的相容 性，适于细胞附 着、伸展和增殖。
O
②微载体的材料元毒性。不仅要求对细 胞的生长元毒性，而且也不会产生影响
产品和人体健康的有害因子。
O ③微载体的材料是惰性的，不与培养基 成分发生化学变化，也不会 吸收培养 基中的营养成分。
O ④微载体的比重为1. 030~ 1. 045 g/ml， 使载体在低速搅拌下就可 悬浮，而在 静止时又可很快沉降，便于换液和收获。
第三章 动物细胞工程制药
--第六节，第七节，第八节
第六节动物细胞大量培养 的方法和操作方式
正如前述，体外培养的动物细胞有的 可在悬浮状态下生长，有的必需贴附在某些 基质上才能生长，有的则在两种条件下都能 生长。因此相应地在生产过程中就要根据所 用细胞的特点，采用最适用的培养方法和操 作方式，以获得最高的生产效率和最大的经 济效益。