最新课件-单克隆抗体

融合细胞的早期培养
10～20天出现克隆 HAT筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选， 即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出 来，通常也称为抗体检测。
体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持 续地无限量供应。
McAb and PcAb
杂交瘤技术的诞生 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然
》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的 融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity ）
单克隆抗体
Monocolonal antibody
1、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）： 用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激
机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。 所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。
2、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗
隆抗体
流 程
（一）小鼠骨髓瘤细胞
小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细 胞都来源于LOU/c大鼠
建立的骨髓瘤细胞系 : SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653 NSO/1
• 不产生Ig的重链和轻链 • HGPRT-;TK• 与提供淋巴细胞的动物品系相同
（二）免疫脾细胞
动 物：
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更 好，且避免了病毒的污染问题
饲养细胞：
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤 细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤 细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖， 这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feeder cells）。
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨 噬细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化
饲养细胞
。
融合方法
a、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中 ，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。 c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。 d、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50% PEG（PH 8.0 ）1ml，边加边轻轻搅拌。 e、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分 钟。 f、1000r/min 5分钟；弃去上清。 g、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔 巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。 h、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将 培养板置37℃，6% CO2培养箱内培养。 i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。 j、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。 l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检 测。
4 2 其后 4 其后“休息” 最后加强
间隔时 间
2-4周
2-4周 每月 2-3月
每月 每天
每月 10天 1-2月
单抗的特性 抗体滴度 亲和性
高
中等至强
中等或高 中等或强
中等
强
中等
中等
中等
中等或强
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序 （引自刘秀梵，1994）
（三）细胞融合
培养液： RPM1640培源自文库液 DMEM培养液
BALB/c小鼠 4～8周龄 20g～25g体重
免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
体内免疫法--免疫原性强、来源充分的抗原，对于 免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的 抗原就不适用了
培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存 于-80℃或液氮及干冰中
免疫脾细胞的制备： 1×108的淋巴细胞 无菌手术
➢取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血 清作为抗体检测时的阳性对照血清。 ➢同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟 ➢通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏 可得5×108-10×108脾细胞。
1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖
一、 杂交瘤技术的基本原理
➢ 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 ➢ HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克 隆化增殖的杂交瘤 细胞系 ➢ 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹 水中即可得到高效价的单克隆抗体
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体 （polyclonal antibody)
第二代抗体 单克隆抗体 （monoclonal antibody)
第三代抗体 基因工程抗体 （genetic engineering antibody)
B淋巴细胞:寿命短,分泌特 异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长，单
淋巴细胞
。
浆细胞
。
抗原接种
。
免疫原特性 免疫原性强 （如细胞、细 菌和病毒等） 免疫原性中等
免疫原性弱
抗原量
接种次数
106-107个细 胞或1-10ug
2-4
10-100ug A.20-400ug
B.10-50ug 其后
200-400ug C.10-100ug
2-4
2-4 随后 2-3
2 其后