慢病毒载体

基本过程
• 由两部分组成，包装成分和载体成分
• 包装成分：HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合的
顺式作用序列而构建；包装成分通常被分开构建到两个质 粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env 蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装 成分与载体成分的3个质粒共转染细胞即可在细胞上清中 收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因 的HIV-1载体颗粒
王烈. 基因治疗病毒载体的研究进展[J]. 医学综述, 2007, 13(7): 490-492.
2.腺病毒(adenovirus, AV)载体
腺病毒是一种二十面体病毒壳体大分子，基因组是一个线性的双链 DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5’端上还具有末端反向重 复序列（ITRs）。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基 因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。
病毒载体和慢病毒载体
Байду номын сангаас
• 基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和 非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、 腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病 毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的 不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将 在基因治疗中继续发挥重要作用 • 逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实 现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。 来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以 感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反 应小等特点越来越受到人们的重视
目前，最主流的腺病毒载体系统有Adeasy系统（ 通过原 核重组极大提高了腺病毒的重组效率）和AdMax系统（改造 后的真核腺病毒包装体系，进一步增加的操作的便捷，同时 滴度较Adeasy有进一步提高）。
第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列(ITRs)和包装信号,载体容量 达37kb,进一步降低了免疫原性,被称为“高容量”载体。AV载体具有宿主 范围广、基因转移效率高、对非分裂细胞也有感染性、比较容易制备和 操作、理化性质稳定、遗传毒性较低及比较安全等优点。
• 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和
整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制 下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
应用前景
1. 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗 2. 神经系统疾病的基因治疗 3. 血液系统疾病的基因治疗 4. 其他疾病的基因治疗，应用于基 因传递系 统，将治疗基 因运送到 目标部位
shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中输送“小 干扰RNA”（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送 入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”（shRNA），并被RNAi通道 处理
3.腺相关病毒(adeno-associated virus,AVV)载体
腺病毒相关病毒(AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒,只有在辅助病毒 如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下,才能进行最佳复制, 产生新的病毒颗粒,否则只能进行潜伏感染。AAV载体既可以转染分裂细 胞又可以转染非分裂细胞,在宿主体内以定向整合的方式存在,70%以上的 整合位点位于第19号染色体q13.3-qter区,且对人体无致病性
4.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体
单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒,作为基因治疗载体， HSV载体非常 适用于需要基因长时间表达的基因治疗,但在介导肿瘤基因治疗等要求基 因短暂高水平表达的基因转移是不合适。
5.慢病毒(lentivirus)载体
概念
• 慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1)
来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、 转染、稳定整合的必需遗传信息。
• 携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、 细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的 病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源 基因在细胞或活体组织中表达 • 慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效 地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目 的序列的效果。
逆转录病毒载体、腺病毒载体：
1.逆转录病毒(retrovirus vectors ,RV)载体
逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分:一部 分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载 体;另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转 录病毒结构基因
将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿 主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可 高效的转染静止细胞,并能抵抗血清补体灭活的作用。
辅助成分
• 辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生 病毒颗粒的细胞系。 • 慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、 重组的假病毒颗粒所需要的所有辅助蛋白。
• 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染 细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外 的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水 平的表达效应分子。
• 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞和一些较难转染的细 胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒 载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，而 且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组 的几率，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 • 在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒 己经成为表达外 源基因或外源shRNA的常用载体形式之一。 • P.s shRNA是short hairpin RNA 的缩写。翻译为“短发夹RNA。