凝胶法检查技术

• 试剂的选择
可使用任一灵敏度的鲎试剂；
一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试
剂；
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试验步骤
• 供试品最大有效稀释倍数的确定
• 例：某样品的内毒素限值为0.5EU/ml，则可以稀释 的倍数和浓度范围如下
灵敏度λ 0.5 （EU/ml)
MVD0.5
0.25 0.125 0.06
0.03
MVD0.25 MVD0.125 MVD0.06 MVD0.03
• 恒温干燥箱 ---具有250℃以上恒温的功能 ---验证：细菌内毒素灭活验证试验 最差装载运行3次 ---监控（建议）：用具细菌内毒素含量 和干扰情况；
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(三）试验器具
• 2.试剂
• 内毒素标准品（RSE或CSE） • 细菌内毒素检查用水 • 凝胶法鲎试剂 • 其他辅剂（抗增液、稀释剂Ⅰ、稀释剂
• 把两支鲎试剂合并后，分别取0.1ml鲎试剂溶液分装 到18支反应试管中。 分别加入0.1mL复溶后的鲎试剂溶液
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4.加样
• 用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、
0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶后
的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿（或分装有0.1ml鲎试剂的
每步稀释于旋涡混 合器混合至少30秒
0.1ml鲎试剂＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管 NC：0.1ml鲎试剂＋0.1mlBET水，平行2管
混匀（水浴恒温需封口）
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操作步骤示意图
37℃±1℃，孵育 60min±2min
结果判断：反应管缓缓倒转180º 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者 实验有效：NC管全部阴性（－－） 2.0λ管全部阳性（＋＋＋＋） 0.25λ管全部阴性（－－－－）
凝胶法检查技术
湛江安度斯生物有限公司 2016年6月
实验助手APP授权发布
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凝胶法检查技术
1 • 凝胶法BET定义 2 • 凝胶法BET试验程序 3 • 试验器具 4 • 鲎试剂灵敏度复核试验 5 • 干扰试验 6 • 检查法
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（一）凝胶法BET定义
• 定义：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的 原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方 法。
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(五）干扰试验
• 目的：确定供试品在某种浓度下是否适 合做细菌内毒素检查。
• 原理：通过比较鲎试剂与内毒素在水溶 液和供试品溶液中反应的差异程度，来 确定供试品在该浓度下是否对BET检查 有干扰。
• 至少对3批样品进行干扰试验
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(五）干扰试验-反应项目设置
编 内毒素浓度/配制 稀释用液 稀释 所含内毒 平行管
凝胶； 不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液。 如有可能，请留一个安全系数。
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(五）干扰试验
结果判断： 当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性， 并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核 试验要求时，试验方为有效。 当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复 核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰 作用。
号 内毒素的溶液
倍数 素的浓度 数
A 无/供试品溶液 ——
—— ——
2
B 2λ/供试品溶液 供试品溶 1
2λ
4
液
2
1λ
4
4
0.5λ
4
C 2λ/检查用水
8 检查用水 1
0.25λ 2λ
4 ChP“4”
（2010
2 年）
2
1λ
2
4
0.5λ
2
8 28
0.25λ 2
(五）干扰试验-反应项目设置
• 注：A为供试品溶液； • B为干扰试验系列； • C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列； • D为阴性对照。 • 供试品溶液要求： 未检验出内毒素的溶液即不与所用鲎试剂产生坚实
鲎试剂的选 择
加样及反应
反应溶液的 制备
MVD的计 算
结果判断
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(五）干扰试验
• 干扰试验通常分为两个阶段：
干扰初筛试验-初步筛选出供试品无干扰浓度
范围和鲎试剂灵敏度范围；-非药典要求！
干扰试验
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(五）干扰试验
• 经常接到用户的咨询电话，样品日常检查需要 选择什么灵敏度的鲎试剂来检测？例如：
• 用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入 每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解 分别加入0.1mLBET水复溶
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3.鲎试剂的准备(大装量试剂)
• 取1.25ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂2支， 在安瓿颈部折断，用精确移液器准确吸取 1.25mlBET水分别加入两支鲎试剂中，使鲎试剂全 部溶解。取18支（10×75）mm反应试管，按照阴性 对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排 列：
• 实验方法： +
3
37±1℃
60±2min
（一）凝胶法BET定义
• 结果判断
• 阳性：凝胶不变 形、不从管壁滑 脱者
阴性：未形成凝胶或形 成的凝胶不坚实、变形 并从管壁滑脱者
（+）
（﹣）
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（二）凝胶法BET试验程序
灵敏度复 核试验
验证
干扰试验
日常检查
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日常检 查
（二）凝胶法BET的试验程序
Ⅱ和分散剂等）
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(三）试验器具
3.试验用具
用具分类
试验用具名称
反应试管 无热原玻璃试管（外径10mm×75mm）
稀释容器 稀释试管、无热原安瓿(2ml/支，5ml/支）
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头等
其他
试管架、安瓿架、70%异丙醇浸泡的无纺布、镊 子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记笔等
开启恒温仪 预热
溶液C的制 备
鲎试剂的制 备
结果判断
恒温反应
加样
数据处理
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操作步骤示意图
内毒素标准品：RSE或CSE
鲎试剂
按说明书 要求
BET水复溶 混匀*
鲎试剂复溶液复溶
轻轻转动 瓶壁摇匀
混匀
稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ 内毒素标准溶液(C溶液)
单次试验试剂：原安瓿 大装量试剂：反应试管
0.4ml 30s
2.0ml 30s
2.0ml 30s
2.0ml 30s
2.0ml 30s
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1
0.5
0.25 0.125
0.06
(2λ)
(λ) (0.5λ) (0.25λ)
单位(EU/mL)
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3.鲎试剂的准备(单次试验试剂)
• 取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18 支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两 管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列；
• 凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。
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(四）鲎试剂灵敏度复核试验
•鲎试剂的标示灵敏度
定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试
剂产生凝集的内毒素的最低浓度； 缩写：λ；
单位：EU/ml； 常用的凝胶法鲎试剂灵敏度有：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml； 安度斯能稳定提供λ为0.015EU/ml的鲎试剂； 比较：以上灵敏度最高的是（）； 最低的是（）。
0.5 0.25 0.125 0.06
NC
反应终 点浓度
X （lg反应终 点浓度）
1 ＋ ＋ ＋ － － 0.125 －0.903
2 ＋ ＋ － － － 0.25 －0.602
3＋＋－－
0.25 －0.602
4＋＋－－
0.25 －0.602
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7.数据处理举例
λc=antilg（ΣX/n）
=antilg{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4}
=0.210EU/ml 即本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc）为0.210EU/ml 结论：本批鲎试剂的灵敏度标示值符合规定。
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何时需做这个试验呢？
1或2会、、内影使试毒响用验素检新条标验批件准结号有品果的任的鲎何改试可变剂能
内毒素标准品(CSE) 安度斯
0.25EU/ml
18支 (2支)
10EU/支
1
BET水(W)
安度斯
50ml/瓶
<0.003EU/ml 1
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1.试验前，将恒温仪预热至37 ℃ 2.标准内毒素溶液C的制备
BET水
1.0ml
3.6ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml
混合5分钟 CSE
NC管全部阴性（－－） 2λ管全部阳性（＋＋＋＋） 0.25λ管全部阴性（－－－－） 当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可 用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为 该批鲎试剂的灵敏度。
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7.数据处理举例
平 行 管
内毒素标准溶液浓度 (EU/ml)
• 我们产品的细菌内毒素限值是0.06EU，需要 订什么灵敏度的鲎试剂，0.03可以吗？
• A、细菌内毒素限值单位不明确，是EU/ml还是 EU/mg还是……？单位不同，选择鲎试剂灵敏度范 围不同；
• B、0.03EU/ml的鲎试剂可不可以，要做干扰试验来 确定；
• C、通常可先做干扰初筛试验，初步筛选出鲎试剂灵 敏度和无干扰浓度范围，再做干扰试验确认。
反应试管）中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（溶液D）
加入另外两管，作为阴性对照
BET水
分别加入CSE0.1mL
0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml
鲎试剂 原安瓿
反应试 管
加样顺序从低浓度到高浓度
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5.恒温反应
• 将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气 泡），垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟 （孵育过程中避免振动影响凝胶形成）
灵敏度复核试验的要求是什么？
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在何种情况下需做干扰试验？
新品种建立方法-两个厂家鲎试剂 鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它有可能影响试验结 果的变化
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试验步骤
试验材料的 准备
供试品限值 的确定
• 结果判断
试验有效条件：溶液D：（- -）；溶液C：（+ +）； 无抑制干扰：溶液A：（- -）；溶液B：（+ +）
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举例：苦参素原料药干扰初筛试验
• （1）供试品限值
– 企业内控标准：＜0.2EU/mg
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（2）试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价 数量
鲎试剂
安度斯 0.1ml/支 0.25EU/ml 24
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（四）鲎试剂灵敏度复核试验
•实验目的
验证实验室的条件是否满足BET实验的要求 验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、 BET用水等）是否满足BET实验的要求 验证实验所用器具是否满足BET实验的要求
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（四）鲎试剂灵敏度复核试验
•试验步骤
数据处理： 灵敏度测定值λc=antilg（ΣX/n） X：为反应终点浓度的对数值（lg） 鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λ c≥0.5λ
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反应终点浓度是系 列浓度递减的内毒 素浓度中最后一个 呈阳性结果的浓度
灵敏度复核试验举例
• 试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价
数量
鲎试剂
安度斯
0.1ml/支 (1.25ml/支)
• 若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应 管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染
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6.结果判断
结果判断：反应管缓缓倒转180º 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱 阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱
＋＋＋＋
阳性
－ －－ －
阴性
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6.结果判断
试验符合要求的基本条件：
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wenku.baidu.com 1.干扰初筛试验
• 目的及原理
– 本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验， 通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液 与鲎试剂的反应，初步筛选出样品对鲎试 验无干扰的浓度
– 本试验不是药典规定的试验
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试验步骤
• 试验材料的准备
• 供试品限值的确定 从国家药品标准、企业标准中查出L 按公式计算：L=K/M
稀释倍数 1
2
4
8
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试验步骤
• 反应溶液的制备
溶液A：将供试品稀释至鲎试剂常规灵敏度下所对 应的MVD
溶液B：含2λ浓度标准内毒素的溶液A 溶液C：2λ浓度的标准内毒素溶液 溶液D：BET水
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试验步骤
• 加样及反应
0.1ml鲎试剂溶液+0.1ml各反应溶液，各平行2管
试验准备
供试品干扰初 筛试验
干扰试验
确定样品内毒 素限值
鲎试剂灵敏度 复核试验
日常检查
选择试剂
计算MVD
结果判断
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（三）试验器具
• 1.设备 • 恒温仪器：
---如干式恒温仪、恒温水浴箱 • 旋涡混合器
---混匀细菌内毒素 • 温度计 • 计时器或时钟 • 微量移液器
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需要定 期校准！
•1.设备