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细菌培养新检测方法【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版细菌培养采样及检查新方法摘录《中华人民共和国国家标准》中《医院消毒卫生标准》一、空气培养菌落总数卫生标准1.标准:(1)产房、门诊人流室:Ⅱ类环境空气平均菌落数≤4.0CFU,暴露时间:15min,(2)母婴同室:Ⅲ类环境空气平均菌落数≤4.0CFU,暴露时间:5min,(3)门诊检普通查室、治疗室、病区:Ⅳ类环境空气平均菌落数≤4.0CFU,暴露时间:5min,2.采样检测方法:(1)产房、门诊人流室空气培养检测方法:设4角及中央1处,共5点,4角的布点部位应距离墙壁1m处,将培养皿放置在各采样点,采样高度为距地面0.8-1.5m,采样时将培养皿盖打开,扣放于培养皿旁,暴露时间15min后盖上培养皿。
(2)母婴同室、门诊检普通查室、治疗室、病区空气培养检测方法:设内、中、外对角线3点,内、外点应距墙壁1m处,采样时将培养皿盖打开,扣放于培养皿旁,暴露时间5min后盖上培养皿。
3.采样结果:送检化验单上报告结果回示:CFU/(皿·暴露时间)。
4.注意事项;(1)每月25日各个部门行空气菌落培养一次。
(2)各个部门应先用含氯制剂擦拭物体表面和拖地,再用动态消毒机消毒2小时或是紫外线灯照射2小时后,在从事医疗活动前,取空气菌落培养。
(3)送检化验单上,必须注明暴露时间,产房注明暴露时间15min,其他部门注明暴露时间5min,现未注明时间不出检查结果。
(4)采样后,立即对样品进行送检,送检时间不超4小时。
二、物体表面菌落总数卫生标准1.标准:(1)产房、门诊人流室:物体表面平均菌落数≤5.0CFU/cm2(2)母婴同室:物体表面平均菌落数≤10.0CFU/cm2(3)门诊检普通查室、治疗室、病区:物体表面平均菌落数≤10.0CFU/cm22.采样时间:各个环境做空气培养后,任选一常用物体表面3.采样方法:用5cm×5cm灭菌规格板放在被检物体表面,用浸有无菌缓冲液的棉拭子1支,在规格板内横竖往返各涂抹5次,并随之转动棉拭子,连续采样1-4个规格板面积,剪去手接触部分,将棉拭子放入装有10ml,采样液的试管中送检。
细菌培养基本方法及其影响因素
概述细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术.细菌在自然界中分布极广,数量大,种类多,它可以造福人类,也可以成为致病的原因.大多数细菌可用人工方法培养,即将其接种于培养基上,使其生长繁殖.培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用.细菌培养是一个复杂的技术. 培养方法以光合细菌培养方法为例.光合细菌培养的方法,按次序分为容器、工具的消毒,培养基的制备,接种和培养管理四个步骤.（一）培养基的制备1．培养用水如果培养的光合细菌是淡水种,菌种培养可用蒸馏水,生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制.如果培养的光合细菌是海水种,则用天然海水配制培养基,注意在海水中加入磷元素时,不能用磷酸氢二钾,应用磷酸二氢钾,不然会产生大量沉淀.2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌.小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒.大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用.3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方.按培养基配方把所需物质称量,逐一溶解,混合,配成培养基.也可先配成母液,使用时按比例加入一定的量即可.（三）接种培养基配好后,应立即进行接种.光合细菌生产性培养的按种量比较高,一般为20％～50％,即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1,不应低于20％,尤其是微气培养,接种量更应高些,否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势,影响培养的最终产量和质量.（四）培养管理光合细菌的培养过程中,管理工作包括日常管理操作和测试,生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面.1．日常管理和测试（1）搅拌和充气：光合细菌培养过程中必须充气或搅拌,作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照,保持菌细胞的良好生长.小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮,每天至少摇动三次,定时进行.大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转,保持菌体悬浮.微气培养是通过充气帮助菌体上浮,因为培养液中溶解氧含量增加,光合细菌繁殖受到抑制,产量下降,所以必须严格控制充气量.一般采用定时断续充气,充气量控制在1～1.5升／（升?h）之间,溶解氧量保持在1×10-6以下.（2）调节光照度：培养光合细菌需要连续进行照明.在日常管理工作中,应根据需要经常调整光照度.白天可利用太阳光培养,晚上则需要人工光源照明,或完全利用人工光源培养.人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡.不同的培养方式所要求的光照强度有所不同.一般培养光照强度应控制在2000～5000lx之间.如果光合细菌生长繁殖快,细胞密度高,则光照强度应提高到5000～10000lx.光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节.（3）调节温度：光合细菌对温度的适应范围很广,一船在23～39℃的范围内均能正常生长繁殖,可不必调整温度.在常温下培养也可通过调整,将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内,使光合细菌更好地生长.（4）酸碱度的测定和调整：在培养光合细菌的过程中,必须注意酸碱度的变化.由于光合细菌的大量繁殖,菌液的pH值上升,这意味着光合细菌正处于指数生长期.但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时,光合细菌的生长达到顶点,随后生长下降.如果能及时调整菌液的酸碱度,使pH值保持在最适范围,则光合细菌能继续生长繁殖.为了延长光合细菌的指数生长期,提高培养基的利用率和单位水体的产量,测定和调整PH值是非常重要的.一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度,醋酸、乳酸和盐酸部可使用,最常用的是醋酸.在日常的管理工作中,必须每天或隔天测定菌液的pH值,当pH值上升超出最适范围,即加酸调整.如果在培养过程中不测定、调整酸碱度,当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上,细菌生长受阻,此时应采收或再扩大培养.在培养过程中不调整PH值,获得的最终产量低.2．生长情况的观察和检查光合细菌生长情况的好坏是培养成败的标准.在培养过程中,可以通过观察菌液的颜色及其变化来了解光合细菌生长繁殖的大体情况,菌液的颜色是否正常,接种后颜色是否由浅变深,均反映光合细菌是否正常生长繁殖以及繁殖速度的快慢.必要时可通过显微镜检查,了解情况.3．问题的分析和处理通过日常管理、检测、检查,了解光合细菌的生长情况,就可以结合当时环境条件的变化进行分析,找出影响光合细菌生长繁殖的原因,采取相应的措施.影响光合细菌生长的原因很多,内因是菌种是否优良,外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等.温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长,而且温度、光照和pH值之间是互相制约的,温度与光照的强弱是对立统一的,所以光合细菌生长的最适条件应是互应的,即温度高,光照应弱；温度低,光照应强.如果是温度高,光照强,pH值就会迅速升高,培养基产生沉淀,抑制光台细菌的生长；如果温度低,光照弱,光合细菌得不到最佳能源,生长速度也慢.经试验得出光合细菌生长的最适条件是：①温度15～20℃时,光照30000～50000lx,培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时,光照为3000～5000lx,培养基的pH值为7.0.。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
选修实验：细菌培养技术
实验三：学习细菌培养的基本技术实验原理：①要根据微生物的营养需要，采用相应的配方配制培养基。
②培养基除满足微生物所需各种营养外，还要适宜的pH 值。
本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基应用广泛，适于多种细菌的培养。
④配置好的培养基必须经过灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌。
在整个细菌接种培养过程中，一般要求无菌操作。
方法步骤：一、培养基的配制 称量 → 溶化 → 调pH 值 → 培养基的分装 →加水加热 边滴边搅拌 趁热分装 棉塞长度2/3在内 外加牛皮纸随时用测pH 值 培养基高度为1/5 挂上标签二、灭菌 高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。
灭菌原理:依据高压升温使菌体细胞蛋白质凝固变性失去生命力,将0.11MPa 、121o C,维持30min 彻底灭菌 操作：加水、装料 → 加热、排气 → 升压、保压 → 降压、排气加开水适当,试管 打开排气阀,加热至沸腾 压力至0.11MPa,T 为121o C 压力降至0,口向上,不能太挤 排气5～10min,关闭 控制热源，保压30min T<100o C 开阀三、搁置斜面当T 接近50o C ，将试管摆在一根木棒上。
培养基形成的斜面不超过试管总长度的一半。
四、接种 微生物接种的各项操作要求必须在无菌条件下进行。
①设备的准备和消毒： 设备：无菌操作箱(无条件可直接在在酒精灯上)，接种环双手 75％酒精消毒 熏蒸法或紫外灯灭菌 灼烧法消毒②采菌：点燃酒精灯→用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管→靠近酒精灯火焰,旋松棉塞→右手拿接种环,在火焰上烧红灭菌→取下棉塞，并灼烧试管口一周→接种环伸入试管，挑去少量菌体，立即抽出 ③接种：迅速将接种环插入培养试管中→在斜面上由管底向管口连续轻划几道蛇形曲线（画线要求：线要划密一些,不要划破培养基,不要使接种环接触到管壁或管口,不重复划）→及时抽出接种环→将试管口在火焰上灼烧，塞上棉塞→熄灭酒精灯,菌种加热倒掉五、保温培养 接种后，试管放在保温箱中，25o C 下培养5～7天(37o C 下培养24h)练习：一、选择题1、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ）A 、防止杂菌污染B 、消灭杂菌C 、培养基和发酵设备都必须灭菌D 、灭菌必须在接种前2、制作细菌培养基时，pH 值应调为（ ）A 、4.5～6B 、7.4～7.6C 、7.8～8D 、2～43、下面的资料表明在各种培养基中细菌的生长（S 、C 、M 为简单培养基，U 、V 、X 、Y 、Z 代表加入培养基的不同物质），问哪一些物质细菌不能合成（ ）A、UB、VC、YD、Z4、细菌培养基常在121o C压力锅中灭菌，如果只是在100o C的温度下降细菌培养基灭菌，以下哪一种生物仍会存活（）A、大肠杆菌B、一种青霉C、枯草芽孢杆菌D、沙门氏菌5、下列操作与灭菌无关的是（）A、接种前用火焰灼烧接种环B、接种前用酒精擦拭双手C、培养基在50o C时搁置斜面D、接种在酒精灯的火焰旁完成6、培养基分装完毕以后，在管口上加一棉塞，下图中哪种加棉塞的操作是正确的（）7、在用高压蒸汽锅灭菌时，其灭菌的正常压力为（）A、49KPaB、98KPaC、9800KPaD、9.8KPa8、高温灭菌的原理是（）A、每种微生物生长的最适温度是一定的B、微生物对于高温环境部适应C、高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动D、高温降低了环境中氧的浓度9、在培养基的配制过程中，下列哪项操作是不正确的（）A、趁热降培养基分装到洁净的试管中，培养基高度为试管长度的1/5B、在溶化过程的最后要补加蒸馏水至100mLC、在调pH值时要随时用pH试纸测pHD、试管加塞后，每10支用绳扎捆，在试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名，就可以进行灭菌10、在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是（）①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上成水平状态②右手拧送棉塞，但不取下③在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞，将它们取下，同时左腕转动，烧灼管口一周。
细菌培养及检测
凝集试验
01
利用细菌表面抗原与相应抗体结合后，可使细菌发生凝集的原
理进行检测。
沉淀试验
02
利用抗原与抗体结合后形成沉淀物的原理进行检测。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
03
利用酶标记的抗体与抗原的特异性结合，再通过酶催化底物反
应放大信号进行检测。
分子生物学检测
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增细菌的DNA片段，达到快速、灵敏地检测细菌的目的。
抗生素敏感性测试
通过细菌培养及检测，可以测定细 菌对不同抗生素的敏感性，帮助医 生选择合适的抗生素进行治疗。
流行病学调查
通过细菌培养及检测，可以对传染 病进行溯源和传播途径的调查，为 防控措施提供科学依据。
食品安全检测
食品中病原菌检测
食品加工环境监测
通过细菌培养及检测，可以检测食品 中是否存在对人体有害的病原菌，如 沙门氏菌、大肠杆菌等。
应用
在临床诊断、药品生产、食 品安全等领域有广泛应用， 如自动血液培养系统、自动 药液生产系统等。
03
细菌检测方法
形态学检测
革兰氏染色法
通过染色将细菌分为革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌两大类，具有
简便、快速、成本低等优点。
抗酸染色法
用于检测分枝杆菌，分枝杆菌细 胞壁中含有大量脂质，不易着色，
但可在抗酸剂作用下着色。
细菌培养的基本原理
适宜的培养基和环境条件
不同种类的细菌需要不同的培养基和环境条件，如 温度、湿度、pH值等。
竞争排斥原理
在培养基上接种菌种时，同一种细菌之间会相互竞 争营养物质和空间，导致生长速度减慢或死亡。
代谢产物的作用
不同种类的细菌会产生不同的代谢产物，这些产物 可抑制或促进其他细菌的生长繁殖。
(完整版)细菌培养技术
第二节细菌培养检测技术节概述细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。
大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定知识点导航一.培养基的种类培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。
适宜的培养基能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。
可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。
（一）基础培养基只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉汤培养基、琼脂培养基。
（二）营养培养基在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细菌生长需要或增菌用。
如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。
（三）选择培养基利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的培养基。
培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别。
选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。
（四）鉴别培养基培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴别和鉴定细菌。
（五）厌氧菌用培养基专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。
（六）特殊培养基为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。
如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。
二.培养基的制备制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和保存。
三.细菌检验室的注意事项及无菌技术细菌培养必须随时为防止污染和病原菌的扩散而进行操作，即无菌操作。
细菌检验室的注意事项如下：1．细菌的培养应在接种罩或无菌室内进行。
有条件的实验室可在超净工作台内进行。
细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术● 考点◇ 基本条件◇ 细菌的接种与分离技术◇ 细菌培养的方法◇ 细菌的生长现象◇ 细菌L型的检查【内容讲解】细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。
分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。
一、基本条件（一）细菌实验室（二）无菌实验室（三）基本设备和器具（一）细菌实验室标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。
对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。
超净工作台应选择垂直气流通风方式。
6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸气灭菌器、干烤箱；冰箱和冷藏柜；接种器具，包括接种环和接种针；pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的培养实验
细菌的培养实验细菌的培养实验是微生物学中的重要实验之一，它帮助我们了解细菌生长的条件以及它们对环境的适应能力。
在本实验中，我们将展示一种常用的培养细菌的方法——琼脂培养法。
实验材料和设备：1. 琼脂培养基2. 细菌液体培养物3. 灭菌的平板、试管、培养皿等4. 灭菌环、移液管、移液枪5. 实验室安全设备，如手套、防护眼镜实验步骤：1. 准备琼脂培养基：将适量的琼脂粉溶解在适量的蒸馏水中，加热煮沸使之完全溶解。
2. 蒸馏水的消毒处理：将蒸馏水倒入试管中，用自动高温高压灭菌器进行高温高压灭菌处理，使其达到无菌状态。
3. 准备试管：取3支无菌试管，用高温高压灭菌器进行高温高压灭菌处理，使其达到无菌状态。
4. 准备移液枪和平板：将移液枪头部进行高温高压灭菌处理，将平板放入高温高压灭菌器中进行无菌处理。
5. 接种细菌：将适量的细菌液体培养物取出并将其移液到无菌试管中，然后将试管倾斜，用灭菌环将液体均匀涂抹在平板上。
6. 培养细菌：将已涂抹细菌的平板放入恒温培养箱中，设定适合细菌生长的温度和时间，让细菌进行培养。
7. 观察结果：在培养时间结束后，取出培养好的平板，观察是否有细菌生长，并记录下细菌的数量和形态特征。
讨论和分析：在实验过程中，我们利用琼脂培养基提供了细菌生长所需的营养物质和适宜的环境条件。
而细菌的液体培养物则作为实验前期的来源，通过适量的接种和平板涂抹，将细菌均匀分布在平板上。
培养箱提供了适宜的温度和湿度条件，促使细菌的生长和繁殖。
实验结果的观察和记录是实验的重要一环，在观察时需要注意细菌的数量、颜色、形状和其他特征。
通过这些观察，我们可以了解到不同细菌对于不同培养条件的反应情况，比如某些细菌在一定条件下会形成菌落，而在其他条件下则可能无法生长。
通过这个实验，我们可以探索细菌生长的规律和影响因素。
并且，细菌的培养实验在医学、食品工业等领域具有广泛应用，它为我们研究和应对细菌感染提供了重要的手段。
细菌的纯培养技术—消毒与灭菌
理化因素对微生物作用的方式 理化因素控制微生物生长繁殖的方式包括杀菌、溶菌、抑菌。 OD值
活菌计数
影响理化因子作用效果的因素：理化因子的强度或浓度、 作用时间长短、 微生物种类、 微生物生理状态等。
一、物理因素对微生物生长的控制
常用的物理因素：加热法、过滤法和辐射法
（一）加热灭菌
当温度超过微生 物的最高生长温 度时，就会出现 致死效应。高温 可引起蛋白质、 核酸和脂肪等重 要生物大分子降 解或改变其空间 结构等，从而使 其功能丧失。
（b）膜滤器（不耐热的液体成分，如 酶或维生素溶液、血清等）由硝酸纤维 素或醋酸纤维素制成。
（c）核孔滤器（液 体过滤）
（a）深度滤器（进 入发酵罐的空气） 介质：棉花、玻璃纤 维、石棉、多层滤纸 等。
优点：不破坏营养成 分和物质的化学性质 缺点：病毒除不掉 （0.22um孔径的滤膜）
膜滤器
超净台
防止措施： 1）特殊加热灭菌法 分别灭菌（糖液；磷酸盐等）； 低压灭菌（含糖类等培养基采用115 ℃灭菌15min） 间歇灭菌 2）其他方法 加入0.01％EDTA或0.01％NTA等螯合剂到培养基中，防止 金属离子发生沉淀； 用气体灭菌剂如环氧乙烷等对个别成分进行灭菌； 过滤除菌法
(二) 辐射灭菌
二、化学因素对微生物生长的控制
抗微生物剂 (Antimicrobial agent)
生物合成的天然产物 人工合成的化合物
一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质
化学物 质的抗 微生物 能力的 测定
液体培养法 最低抑制浓度（MIC）试验 最低抑制浓度：抑制某病原菌生长的最低浓度。
平板培养法 抑菌圈（zone of inhibition）试验
工业生产常用的消毒剂
微生物检验学之细菌的培养与分离技能技术总结
精心整理细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室1.2.3. 4. 5.菌处理。
6.7. 1. 2. 3.4. 5. pH二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。
常用的平板划线分离法有以下两种： 1.连续划线分离法杂菌不多的标本。
2.分区划线分离法杂菌量较多的标本。
（二）斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。
（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。
（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。
应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏；若为生长阴性，应孵至第7天弃去。
有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。
血培养孵育24h后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有105菌落形成单位CFU/ml，才能通过革兰染色检出细菌。
（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。
五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。
项目四：微生物培养技术
生长因子等。 （二）温度 ：依据细菌对温度的需求不同，可将分为嗜冷菌、
嗜温菌、嗜热菌三大类。大多数病原菌的最适温度为37℃。 （三）PH：大多数细菌的最适pH7.2～7.6 （四）渗透压：细菌细胞需要在适宜的渗透压下生长繁殖 （五）气体：与细菌生长繁殖有关的气体主要是氧和二氧化
（二）根据培养基的用途分：
1、基础培养基 ：如牛肉膏蛋白胨琼脂 这种培养基可供培养一般细菌使用。
2、营养培养基 ：如加血液、血清、葡萄糖、酵母 浸膏等，可供营养要求较高的细菌生长。
3、选择培养基 ：如培养沙门氏菌的培养基中加入 四硫磺酸钠、亮绿，可以抑制大肠杆菌的生长。
4、鉴别培养基 ：如醋酸铅培养基、麦康凯培养基， 依靠指示剂的颜色反应，借以鉴别不同种类的细 菌。
(1)热原质 许多革兰氏阴性菌与少数革兰氏阳性 菌在代谢过程中能合成一种多糖物质，注入人 体或动物体能引起发热反应，称为热原质。
(2)毒素 毒素的产生与细菌的致病性有关，细菌 产生的毒素有内毒素和外毒素两种。
(3)细菌素 是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌 作用的蛋白质 。
(4)维生素 动物机体的正常菌群能合成维生素B和 维生素K，可被机体利用。
5、厌氧培养基 ：如疱肉培养基，可供厌氧菌生长。
(三)按培养基的成分
（1）合成培养基：营养物质的成分及其浓度完全清楚；组 分精确；重复性强。但微生物生长缓慢，所用各种物质成 本昂贵，只在实验室里使用。
（2）天然培养基：采用动植物组织、微生物浸出物等，如 牛肉高蛋白质、玉米粉、麦芽汁、麸皮、马铃薯、酵母膏， 等皮革厂、肉食品加工厂、淀粉厂的付产品配制成。不稳 定、不精确。微生物生长良好，培养基易得，成本低廉， 适于大生产中配制培养基。
细菌培养方法
细菌培养方法细菌培养是微生物学实验中非常重要的一环，它可以帮助我们研究和分离不同类型的细菌。
正确的细菌培养方法可以保证实验结果的准确性和可重复性。
下面将介绍一些常用的细菌培养方法。
首先，我们需要准备培养基。
培养基是细菌生长和繁殖的基础，不同的细菌需要不同种类的培养基。
常见的培养基包括营养琼脂、大肠杆菌培养基、莱菲尔曼培养基等。
在制备培养基的过程中，需要根据不同的细菌需求添加不同的营养成分，比如葡萄糖、氨基酸、维生素等。
其次，我们需要进行无菌操作。
无菌操作是细菌培养中至关重要的一步，它可以有效地防止外源细菌的污染。
在进行无菌操作时，我们需要将培养基和培养器具置于高温高压下进行灭菌处理，然后在无菌工作台上进行操作，确保操作过程中不会受到外界细菌的污染。
接着，我们需要将细菌接种到培养基上。
在接种过程中，需要先将培养基加热至适宜的温度，然后将细菌悬液均匀地涂抹在培养基表面。
接种后，需要将培养皿或试管放置在适宜的温度下进行培养，不同的细菌对温度的要求也不同，一般有25℃、37℃等。
最后，我们需要进行细菌的纯化和分离。
在培养过程中，常常会出现不同种类的细菌混合在一起的情况，这时就需要进行纯化和分离。
常用的方法包括单菌落法、传代分离法等，通过这些方法可以将不同种类的细菌分离出来，进行进一步的研究和分析。
细菌培养方法的正确与否直接影响到实验结果的准确性和可重复性，因此在进行细菌培养时，需要严格按照操作规程进行操作，确保每一个步骤都符合要求。
同时，也需要根据具体的实验要求选择合适的培养基和培养条件，以获得最佳的培养效果。
总之，细菌培养是微生物学实验中不可或缺的一环，正确的细菌培养方法可以为我们提供可靠的实验数据，帮助我们更好地了解和研究细菌的生长和繁殖规律。
希望本文介绍的细菌培养方法对您有所帮助。
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第二节细菌培养检测技术节概述细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。
大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定知识点导航一 .培养基的种类培养基（ culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。
适宜的培养基能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。
可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。
（一）基础培养基只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉汤培养基、琼脂培养基。
（二）营养培养基在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细菌生长需要或增菌用。
如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。
（三）选择培养基利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的培养基。
培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别。
选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。
（四）鉴别培养基培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴别和鉴定细菌。
（五）厌氧菌用培养基专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。
（六）特殊培养基细菌培养之用。
如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养为某些需要在特殊条件下才能生长的基、改良 Kagan 氏培养基等。
二 .培养基的制备制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH 、过滤、分装、灭菌及检定和保存。
三 .细菌检验室的注意事项及无菌技术细菌培养必须随时为防止污染和病原菌的扩散而进行操作，即无菌操作。
细菌检验室的注意事项如下：1．细菌的培养应在接种罩或无菌室内进行。
有条件的实验室可在超净工作台内进行。
2．用接种环分离和移种细菌时，用前用后均需灭菌处理。
一般采用火焰灭菌法。
3．从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开瓶口、管口或关闭前，均要在火焰上通过2～ 3 次。
切不可将含菌材料污染台面和其他物体。
4 ．如不慎将试管等打破造成菌液污染时，不要惊慌，应立即报告负责人，然后用3％来苏或 5％石炭酸处理污染台面或地面，至少浸泡30 分种。
5 ．工作完毕后，用紫外光灯照射30 分钟，或用3％来苏擦拭台面，并清洗双手。
四、接种环和接种针使用接种环和接种针由三部分组成，即环（针）部分、金属柄部分和绝热柄部分。
接种环和接种针通常选用电热（镍）丝，环的直径随使用目的而不同，一般多为2～ 4mm ，环和针的长度为40 ～50mm 。
接种环（针）使用前后均应进行灭菌处理，将接种环（针）末端直立火焰中，烧红镍丝部分，再使接种环（针）金属柄旋转通过火焰 3 次灭菌，冷却后用以取菌或待试标本。
使用接种环（针）完毕后立即将染菌的镍丝部分于还原焰（内焰）中加热，烤干环（针）端附着的细菌或标本，以免环（针）上残余的细菌或标本因突受高热，爆烈四溅，而污染环境和导致传染危险。
然后再移于氧化焰（外焰）中烧红灭菌，最后将金属柄部分往复在火焰中通过 3 次。
用完后的接种环（针），应立即搁置于架上，切勿随手弃置，以免灼焦台面或其他物件。
五、接种操作区为避免在接种过程中污染环境以及空气中的细菌污染培养物，接种均应在接种罩或无菌室内进行，此外细菌学实验室所必需的设备还包括无菌工作台、生物安全柜和生物安全实验室。
（一）接种罩接种罩的式样很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有机玻璃制成。
接种罩在用前先以 3％石炭酸或来苏轻拭，内需装有紫外线杀菌灯，用前可先行照射，以保证罩内无尘埃和细菌。
操作结束后，应立即清理内部，并作罩内消毒处理。
（二）无菌工作台又称超净工作台（ super clean bench 式。
通过变速离心风机将负压箱内经过预滤器过滤的空气压入静压箱，），目前多采用垂直层流的气流形再经高效过滤器进行二级过滤，从出风面吹出的洁净气流，以一定的和均匀的断面风速通过工作区时，将尘埃颗粒和微生物颗粒带走，从而形成无尘无菌的工作环境。
使用时应提前50 分钟打开紫外线杀菌灯，30 分钟后关闭并启动送风机。
净化区内严禁存放不必要的物件，以保持洁净气流型不受干扰。
（三）无菌室无菌室又称洁净室（clean room ），是在实验室内部安装的用于无菌操作的小室。
室内应有空气过滤装置、紫外线杀菌灯等。
（四）生物安全柜（biological safety cabinet，BSC）目前微生物试验中多采用生物安全柜，是为操作原代培养物、菌（毒）株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的负压过滤排风柜。
（五）生物安全实验室（Biosafety Laboratory），简称“BSL实验室”，是指通过规范的实验设计、实验设备的配置、个人防护装备的使用等建造的实验室。
在结构上由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（设施）构成，实验室生物安全防护的安全设备和设施的不同组合，构成了四级生物安全防护水平，一级为最低。
六、接种法根据待检标本的性质，培养目的及所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
常用的有平板划线分离培养法、斜面接种法、液体接种法和穿刺接种法。
（一）平板划线分离培养法分离培养法就是通过划线使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面逐一分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。
分离细菌最常用的为平板划线分离法。
1．将接种环火焰灭菌，待冷却后取标本或混合菌液。
2．用左手持起平板，使平皿盖向上放于台面上或打开平皿盖。
3 ．左手斜持（45 ℃角）平板，右手持已取材的接种环，在酒精灯上方5～ 6cm 处作连续划线法分离细菌。
划线时，接种环与平板呈30 ～ 40°角，轻轻接触平板，以腕力平行滑动接种环。
应避免将琼脂划破。
先在平板上 l／ 5 处轻轻涂布，然后即可左右来回以作连续划线接种，线与线间留有适当距离，做到线密而不重复，将整个平板表面布满划线。
如果菌量较大可采用分区划线法。
可将平皿分为若干个区（一般为 5 个区）。
先在平板上l 区轻轻涂布，再在2， 3区划线。
每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，冷后再化下一个区域。
每一区域的划线均接触上一区域的接种线l～ 2 次，使菌量逐渐减少，以获得单个菌落（见图20-1）。
图 20-1细菌分离接种法4．划线完毕，盖好皿盖，做好标记将平皿倒置，置37 ℃培养18 ～ 24 小时后观察结果。
（二）斜面接种法主要用于划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以得到纯种细菌和保存菌种，以及观察细菌的某些培养特性。
1．取菌种管置左手食指、中指、无名指之间，拇指压住管底部上侧面。
2．火焰灭菌接种环。
3．以右手小指与手掌拔取棉塞（如同时持有两管，可用小指与无名指拔取另一棉塞），将管口迅速通过火焰l～ 2 次。
4．将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取少许菌，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜37 ℃孵箱中面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。
培养18 ～ 24 小时即可观察结果。
（三）液体接种法肉汤、胨水、发酵管等均系液体培养基。
用于增菌，观察细菌生长现象和检测细菌的生化反应等。
1．持好菌种管及培养基管。
2．灭菌接种环，由菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使接种物充分混合于培养基的液体中。
3 ．液体培养一般以18 ～ 24 小时观察生长特征为好。
（四）穿刺接种法试管内半固体培养基采用此法接种，多用于保存菌种、观察动力及做厌氧培养等。
亦可用于观察细菌的某些生化反应。
1．持好菌种管和培养基管。
2．以灭菌接种针从菌种管取菌。
3 ．接种针直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达管底部（深入培养基3/4 处）或沿管壁刺入（醋酸铅高层），接种后接种针应沿原路退出。
4．经培养后即可观察结果。
沿穿刺线生长，线外的培养基清亮者表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊者表示细菌有动力。
七、培养法根据培养目的和细菌的种类选用最适宜的培养方法。
常用的有一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
（一）一般培养法一般培养法系指需氧菌或兼性厌氧菌等在需氧条件下的培养方法，故又称需氧培养法。
将已接种好的置37 ℃孵箱中培养18～24 小时。
但标本中菌量很少或难于生长的细菌（如结核分技杆菌）需培养 3～ 7 天甚至l 个月才能生长。
（二）二氧化碳培养法某些细菌的培养，需要5～ 10% 二氧化碳环境中培养才能生长良好。
可采用二氧化碳孵箱，它能自动调节二氧化碳的浓度和温度，使用极为方便。
传统的方法则采用烛缸法，将培养基放入缸内，点燃蜡烛放在缸中，加盖（涂以凡士林）密闭。
因燃烧而产生 CO2 大约占 5～ 10% ，基本可满足细菌培养的要求。
（三）厌氧培养法厌氧菌标本的采集及运送有特殊的要求及注意事项，应避免正常菌群的污染，尽量少接触空气并立刻送检。
厌氧菌的培养法可大致分为：①物理学方法：遮断空气法（层积法）、真空法、空气置换法、厌氧罐培养、厌氧袋法、厌氧手套箱等。
②化学方法：焦性没食子酸法、硫乙醇酸钠法、黄磷燃烧法。
③生物学方法：需氧菌共生法、燕麦发芽法。
④混合法：真空或气体置换与焦性没食子酸法相结合，可根据实际情况选用。