茯苓多糖的提取及其抑菌研究

茯苓多糖的提取及其抑菌研究

胡朝暾, 肖 毅, 周鹏飞, 付 明, 胡 兴

(怀化学院11生命科学系; 21民族药用植物研究与利用湖南省重点实验室,

湖南怀化 418008)

摘 要:对茯苓多糖的提取方法和抑菌试验进行了初步的探索1设计了两种不同提取茯苓多糖的方法,分别为:稀碱浸提法和水提醇沉法1通过比较上述两种不同方法的多糖提取率,发现稀碱浸提法的提取率较高,是一种较好的茯苓多糖的提取方法1另外采用纸片扩散法(K-B 法)对两种方法所提茯苓多糖进行抑菌试验,实验结果表明:茯苓多糖对革兰氏阳性菌和阴性菌都有一定的抑制效果,特别对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌效果明显1

关键词:茯苓; 茯苓多糖; 多糖提取; 抑菌试验

中图分类号:Q949195 文献标识码:A 文章编号:1671-9743(2012)08-0015-04

收稿日期:2012-07-28

基金项目:湖南教育厅一般项目(09C756);怀化学院青年基金项目(HHUQ2009-12);民族药用植物研究与利用湖南省

重点实验室委托项目(HHUW2011-53)1

作者简介:胡朝暾(1977-),男,湖南安化人,怀化学院讲师,博士生,主要研究蜘蛛生理学、生态学和蜘蛛毒素1

茯苓(poria cocos (Schw 1)Wolf)为多孔菌科卧孔菌属真菌茯苓的干燥菌核,多依附松树根生长1茯苓主要分布在我国的云南、贵州、湖北和湖南等地[1]1是我国传统的中药材和历史悠久的食品,也是湖南靖州重要的生物资源1在中国传统医学中,茯苓的药用已有二千多年的历史了15神农本草经6中,把茯苓列为上品,有/久服安魂养神,不饥延年0的作用1此外,茯苓也是我国一种历史悠久的食品1早在唐朝集市食摊上就有用茯苓、糯米、白术磨粉制成的茯苓糕,后来先后又出现了茯苓包子、茯苓粥1因此,茯苓也是国家卫生部、国家中药管理局颁布的/既是食品又是药品的品种名单0的一种1药理实验表明茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力及降低血糖的功效[2-5]

1其中主要功能体现者为

茯苓多糖1

茯苓多糖(pachy man)是近年来研究较多的一种真菌多糖,约占整个茯苓菌核干重的70%-90%[6]1茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力、保肝、催眠、抗炎等作用[7],可广泛应用于医疗保健、食品等领域1茯苓多糖可用于抗肿瘤药物的研发,从而为肿瘤、癌症的治疗提供新的方法,还可作为免疫增强剂,用于保健品的开发与研制1因此,茯苓多糖的提取及开发意义重大1故对茯苓多糖的提取进行探索,并对其抑菌效果进行初步的检测1

2 材料与方法

211 材料

茯苓:购自湖南怀化市靖县茯苓大市场1带回实验室后切成小块后用粉碎机粉成粉末,放入30e 的烘箱中干燥后备用1

枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌来自怀化学院生命科学系微生物学实验室1212 试剂与溶液的配置21211 基本培养基:

牛肉膏3克,蛋白胨10克,NaCl 5克,琼脂5克,水1000ml 、pH 710~712、121e 灭菌20min 121212 5%苯酚试剂的配制:

称取苯酚5g,加水100ml 使溶解,至棕色瓶中,得浓度为5%苯酚试液121213 标准葡萄糖溶液的配制:

精密称取105e 干燥恒重的葡萄糖50mg,加水溶解并定容至1000ml 容量瓶中121214 茯苓多糖溶液的配制:

精密称取茯苓多糖50mg,加水溶解并定容至500ml 容量瓶中,过滤,滤液备用121215 015麦氏比浊管的配制

01048mol P L 的Bacl 2015ml 和0118mol P L 的H 2SO 4

第31卷第8期

怀化学院学报 Vol 1311No 182012年8月

JOURN AL OF HUAIHUA U NIVERSITY

Aug 1,2012

9915ml充分混匀1

21216其他的试剂:

乙醇,丙酮、乙醚、氢氧化钠、稀醋酸、二甲基亚砜、鞣酸、活性炭等试剂为国产分析纯1

213实验仪器

德国进口SI GMA3-18K高速冷冻离心机;美国进口的D U-800紫外可见分光光度计;上海大普仪器有限公司P HS-3C高精度酸度计;余姚市东方电工仪器厂202-3A电热恒温干燥机;上海之信仪器有限公司JY99-IID超声波细胞粉碎机;佛山顺德格兰仕微波炉电器有限公司WP800TL微波炉

214茯苓多糖的提取方法

21411稀碱浸提法

准确称取茯苓粉末10g溶于4e0115mol P L NaO H 2000ml液中,搅拌至粉末溶解,此时溶液呈粘稠状态;4e以下冷藏,过夜,抽渣弃去,滤液以10%的醋酸液中和至pH610,再加入等体积95%乙醇,于4e 放置过夜;8000r P min离心取沉淀,流水透析两天1再依次用蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后,减压抽干,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品,呈淡黄色细颗状结晶1

准确称取茯苓多糖粗品5g,溶于500ml二甲基亚砜中,在室温下用磁力搅拌器搅拌15h后,加入500 ml蒸馏水,继续搅拌20min,放置2h,8000r P min离心得沉淀1沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,冷冻干燥,即可得茯苓多糖纯品1

21412水提醇沉法

准确称取茯苓2g,切成碎片,加入200ml的水,重复提取3次,每隔2h提取一次1合并3次提取液过滤,除去不溶性杂质,得滤液1取上述所得滤液,减压蒸馏浓缩,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80%,静置12h,8000r P min离心得沉淀,收集沉淀1溶解煮沸加蒸馏水60ml,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下再加入乙醇,使含醇量达到80%,放置,析出褐色沉淀后,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品1

将粗品溶于150ml蒸馏水中,煮沸,在搅拌下加入1%鞣酸溶液,煮沸,8000r P min离心1取上清液加入鞣酸溶液不混浊为止1加入2%的活性炭,搅拌10 min,趁热用布氏漏斗滤过,滤液放冷,加入乙醇使含醇量达到70%,静置24h,滤取析出物1用70%乙醇100ml,反复洗涤沉淀,检查不含鞣酸为止(也就是当上清液中不出现混浊为止)1将湿品溶于一定量的20%热乙醇中,置于布氏漏斗中过滤,减压后,再加入60e热蒸馏水连续洗脱,流出液减压浓缩,加入乙醇使含醇量达到70%,放置,滤取沉淀冷冻干燥,即得茯苓多糖纯品1

215多糖含量的测定

茯苓多糖的测定主要采用Dubois等提出的苯酚-硫酸比色法[8]1该方法的原理为[9]:糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定1

216茯苓多糖抑菌实验

抑菌试验采用K)B纸片扩散法进行,具体过程如下:先用普通培养基对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌进行活化1活化好之后,将枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌,以浓度约为5@107 cfu P ml的菌量分别接种到普通营养培养基表面1将两种方法所提茯苓多糖配置为1mg P ml的溶液,以无菌操作将在两种茯苓多糖溶液中和无菌水中浸泡1h的直径为014c m的滤纸片分别贴到培养基上,37e培养24h1每个试验做3个平板重复1最后观察抑菌效果1

3结果与分析

311茯苓中多糖的含量

31111标准曲线的制作

按照标准曲线的制作方法配制溶液,充分混匀,静置20min于490nm处比色,记录A

490

值,记录在表1中1

表1标准葡萄糖溶液的A

490

值

管号123456789 A49000104601109011370119701242012890134201405

用标准葡萄糖含量(mg)为横坐标,用吸光度值A490为纵坐标,用标准曲线计算程序软件作图,即得到一条标准曲线,见图11

#

16

#怀化学院学报2012年8月