第四章基因组文库

真核基因组 DNA
λ 取代型λ 噬菌体载体
COS Charon 4A 机械剪切 EcoRI EcoRI 酶切 加人工接头 酶切
连接
cos
体外包装
cos
转染 E.coli
三.质粒载体构建cDNA文库
双链质粒 DNA 5’ pBR322 5’ 3’ RT 酶 限制酶 用 NaOH 降解 mRNA 用 Klenow 酶合成第二链 3’ AAAAAAn 加锚定引物(寡聚 T) 3’ AAAAAn 5’ TTTT
TTTTTT AAAAAA
通过以下途径将 cDNA 插入载体 a. 平端克隆 b. 加接头 c. 进一步进行同聚物加尾反应
第二节 构建文库的载体
一.λ 噬菌体载体 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同 组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含 一些共同和特异序列。这可用于分离差异表 达的基因。 (3)cDNA文库的 DNA无内含子、调节元件和 基因间 DNA。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
(3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：>2000kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆 的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析， 有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。
ln(1 0.99 ) N ln(1 17 kb / 30 Mb)
= 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时， 所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99％的概率得到此克隆。
五. cDNA文库
一.概况: cDNA文库是通过反转录 mRNA，并制备双链 cDNA(double stranded cDNA)来构建的。 构建cDNA文库的策略是取决于： (1)目的mRNA的相对丰度； (2)筛选方法： 除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各 种方法进行鉴定。
表 24.4 根据所提供的来源和信息，从 cDNA 或基因组文库中分离基因的策略 所提供的信息 功能克隆-不需要表达 高度度 mRNA 已知部分序列 有部分克隆或同源序列 已知部分多肽序列 两种组织中表达差异 cDNA 表达的功能克隆 提供突变 提供抗体 特异性的产物 定位克隆 提供结构突变 由转座子插入引起的突 变 基因在染色体上的位置 筛选策略 丰富克隆—从 cDNA 文库中随机选择克隆，测序确定产物 用寡核苷酸探针筛选 a 在低严格条件下用克隆的片段或同源基因筛选 用简并性寡核苷酸[猜测体(guessmers)]筛选文库 差减筛选，通过差减杂交得到富含差异表达克隆的文库 通过对突变表型的互补筛选(表型恢复) 同免疫检测筛选文库 通过特殊技术筛选文库，如对 DNA 结合蛋白的 southweatern 杂 交，相互作用蛋白的酵母双杂交体系，酶对底物的转化等 如果突变由缺失引起，从基因组消减文库来克隆 如果突变由插入或转座子件引起，用转座序列作为探针筛选突 变体文库，通过质粒拯救分离克隆 通过从相关标记或染色体断点相连接的染色体步移(chromosome walking,)定位克隆，标记可能是增强子包载载体的转座因子
HindIII Cos NotI Z T7 ParC SP6 NotI
CM
r
HindIII 部分酶切
ParB ParA
BAC oriS PFGL repE HindIII CIP
Pulsed-field gel electrophoresis
连接
(2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性 筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝， 但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。
2.制备cDNA文库
分离代表细胞中主要 mRNA(rRNA和tRNA因其丰 富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。 mRNA 的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。 然后被反转录。cDNA第一链的合成用 oligo(dT) 引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此 中部可加另一引物。第二链 cDNA 的合成是用 自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第 一链加尾(如多聚胞嘧啶 )，然后用oligo(G)为 引物起始第二链的合成。这样产生的双链 cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段 大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因 组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量 供体DNA。
第三节 文库的筛选
(1)用特异探针进行分子杂交； (2)用免疫和生化方法来检测基因产物； (3)用特异性引物进行PCR扩增。
二.cDNA的筛选
(1)最佳的cDNA文库其mRNA在细胞中高水平 特异表达； (2)有的目的mRNA的丰度极低，那么就应选 择其丰度相对较高的细胞来构建文库，并要 计算好文库应具有的克隆数； (3)细胞中某种蛋白质的表达量常常是表明 mRNA丰度的敏感指标。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是 中心“ 填充片段”gam和red基因座丢失引起 的。 供体DNA的大小： 插入载体：0-10kbp; 置换载体：9-23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基 因组 75-105％所限制。 主要应用： 插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。 置换载体:基因组DNA克隆。
SI 酶降解发夹结构 末端转移酶 dGTP 末端转移酶加寡聚 C CCC CCC GGG GGG 连接
转化 E.coli 扩增 以质粒为载体构建 cDNA 文库
四.大容量克隆载体
基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。
载体 YAC(酵母人工染色体) 系统 酵母着丝粒 ,复制起始 点和端粒 克隆容量 200kb～2Mbp 评价 嵌合发生率高 ( 在基因组 中不相连的连续片段)； 不稳定(自发缺失)； 很难与酵母染色体分离； 稳定，但在细菌外难以维 持
2.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。 高速搅拌：1500转/分×30分 可切 平均 长度8kb的分子群体。 3.双酶消化 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
cDNA文库的优点
(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库； (2)因克隆数比基因组文库少得多源自文库易于 筛选； (3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分 离到特异表达的基因。 (4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳 性率减低。 (5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多 种策略进行筛选。
第四章 基因组文库的构建
基因组文库(genomic library) 即基因文库(gene bank) 是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组 DNA克隆群体。 构建基因文库时先提纯生物的总DNA，通过机 械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。 二. DNA片断大小的分部 如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。 三.目的基因克隆片段的富集。
CEN4 ARSI TRPI Amp ori TEL
EcoRI
SUP4
URA3 TEL BamHI BamHI BamHI 和 Ecoli 双酶切
DNA EcoRI 部分酶切
PFEG(pulsed field gel electrophorcsis ) 脉冲电泳 变角电场电泳
连接
一.基因组DNA文库的筛选 筛选DNA文库是分离目的基因常用的方法； 在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且 大多数基因的产物不具有可选择的表型特征， 因此可采用以下策略来进行筛选：
cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多 克隆的过程，最终可建立cDNA文库。
建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因； 2.是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中 分离稀有的cDNA克隆。 建库的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA 序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
四.克隆数的确定
任一DNA序列在文库中出现的概率：
ln(1 p ) N ln(1 I / G )
N:该序列需要克隆的总数； p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率， 一般为99％； I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
将数据代入上式
PAC(P1 人工染色体) BAC(细菌人工染色体) MACs( 哺乳类人工染色 体)
细菌噬菌体 P1 F 质粒 基于 Epstein-Barr 病 毒的游离载体
100～300kb 300kb >300kb
人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒
AAAAAAA mRNA (a) 随机六碱基 (b)寡聚(dT)引物 第一条 cDNA 的合成 An An NNNNNN Tn (c)发夹引物 第二条 cDNA 的合成 TTTTTT GGGGGG CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG AAAAAA CCCCCC 切除发夹 TTTTTT AAAAAA 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克隆 (d)同聚物加尾反应 TTTTTT
二. 粘粒(cosmid)载体 基础：包含λ 噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入 的阳性筛选； 供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有 效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限 制。 主要应用：基因组文库构建。
组织
载体 ( 选择一种)
mRNA cDNA
DNA
部分或完全 消化的 DNA
甲基化，加接头 的双链 DNA
大小分级
可供克隆的 DNA 片段 连接 DNA 片段和载体 重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化) 基因库的鉴定与效价测定 筛选目的基因 扩增文库长期保存
构建基因组 DNA 和 cDNA 文库的流程示意图