黑曲霉发酵产酶研究进展

黑曲霉发酵产酶研究进展

张熙;韩双艳

【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种,它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素,是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一,也是重要的酶制剂生产菌种.综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展,并展望了其广阔的应用前景.

【期刊名称】《化学与生物工程》

【年(卷),期】2016(033)001

【总页数】4页(P13-16)

【关键词】黑曲霉;酶;发酵产酶

【作者】张熙;韩双艳

【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006

【正文语种】中文

【中图分类】Q939.97

黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。

黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重

组子具有很高的遗传稳定性。随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。

纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。纤维素酶不仅在传统的医药、食品、饲料、饮料、酒类、酱油等行业有应用价值，而且扩展到单细胞发酵、纺织、造纸、环保、能源等新领域。黑曲霉是产纤维素酶产量最高的菌株之一[3]，目前国内外基于黑

曲霉发酵产纤维素酶的研究也较为集中。

高星星等[4]为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果，以碱性双氧水处理过的玉米秸秆

为发酵基质，通过里氏木霉与黑曲霉混合发酵，获得最佳产酶条件。结果发现，滤纸酶活力(FPA)可达1.224 IU·mL-1，β-BG可达0.315 IU·mL-1。

先天敏等[5]通过单因素实验及均匀设计法实验研究了黑曲霉C112发酵产β-BG

的最优条件，所得酶活力最大可达12.925 IU·mL-1，较优化前提高了79.0%。

董基等[6]以桔粉为原料，以黑曲霉为发酵菌株，采用液体发酵法生产纤维素酶。

结果发现，在添加桔粉80 g·L-1、麸皮和蛋白胨质量比为1∶2下培养72 h，纤

维素酶产量达到1 885.71 U·g-1。

Acharya等[7]研究了不同木屑培养环境下黑曲霉产木质纤维素酶的最优条件。结

果表明，在碱(2 mol·L-1NaOH)预处理木屑浓度9.6%、pH值4.0~4.5、深层发

酵转速120 r·min-1、发酵温度28 ℃时，纤维素酶活力最大达0.1813 IU·mL-1。

黑曲霉发酵产纤维素酶的产量大、活力高、优化程度高、酶功能完整、用途广泛，是一种生产纤维素酶的良好手段。

半纤维素是植物纤维素的主要组成成分，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生生物资源，广泛分布于高等植物的细胞壁中。木聚糖酶通常是内切和外切木聚糖酶的总称，作用于木聚糖主链内部的木糖苷键，将其切断并降解为寡聚木糖和少量单糖。木聚糖酶的工业化始于1980年左右，最初应用于饲料工业，饲料中添加木聚糖酶系可使植物性饲料更加容易被消化吸收。后来又扩展到食品、纺织和造纸等工业。木聚糖酶作为重要的酶制剂在市场上的份额占总销售额的10%[8]。黑曲霉是发酵产木聚糖酶的菌种之一，目前国内外有很多关于提高黑曲霉产木聚糖酶表达的最新研究。

刘新育等[9]对黑曲霉孢子进行热击处理，探讨了热击处理促进孢子萌发和木聚糖

酶活力的机制。结果表明，42 ℃下热击4 h后转入29 ℃发酵，可促使黑曲霉孢

子较早萌发和菌丝较快生长。其中，发酵24 h的菌丝干重提高了38.5%，发酵

72 h时达到最大生物量，较未处理的提前了12 h。热击处理后的发酵产酶总量和单位质量菌丝产酶量均高于恒温发酵，热击处理对木聚糖酶的种类并没有影响。Okafor等[10]从废旧木材中分离出一株野生黑曲霉菌株ANL301，研究了其在不

同碳源(燕麦木聚糖、木屑、甘蔗浆和小麦糠)下产木聚糖酶的活性。结果表明，发酵96 h后，木聚糖酶活力分别为9.36 U·mg-1、3.37 U·mg-1、5.69 U·mg-1和3.86 U·mg-1。

Betini等[11]将雪白曲霉、黑曲霉和赭曲霉以农业剩余料为底物进行固态发酵产木聚糖酶。其中，黑曲霉在培养基为麦糠和酵母提取物(或蛋白胨)混合物时产酶提高；当以玉米糠和麦糠为混合底物时，黑曲霉的木聚糖酶产量提高了18%，木聚糖酶

活力达35 U·g-1。

Dobrev等[12]优化了黑曲霉B03产木聚糖酶的液体发酵条件。研究得到最优培养

基为(g·L-1)：(NH4)2HPO4 2.6，尿素0.9，玉米芯24.0，麦麸14.6，麦芽6.0。优化后的酶活力最高达996.30 U·mL-1，较优化前提高了33%。

黑曲霉发酵产木聚糖酶获得了较高的产量、开发了廉价的农业生产底物，为木聚糖酶的工业化生产提供了良好的基础和条件。

蛋白酶是水解肽键的一类酶的总称。按照水解方式的不同，蛋白酶可以分为内肽酶和外肽酶两种。内肽酶主要以蛋白质分子链中间的肽键为作用位点，可以把蛋白质分子切断成为较短的肽链；外肽酶主要从蛋白质分子的末端氨基或羧基进行逐个切割。蛋白酶主要应用在医药、食品、皮革纺织后加工等领域[13]。工业上主要的蛋白酶制剂生产菌株为枯草杆菌、栖土曲霉等。黑曲霉以其食品卫生认可和可观的蛋白酶表达量，也日益成为另一个重要的蛋白酶发酵菌株。国内外的研究主要集中在发酵培养基的组成方面[14]。

方春玉等[15]以泸型大曲中分离的黑曲霉为菌种，采用固态发酵产酸性蛋白酶，酸性蛋白酶活力达24 350 U·g-1，平均酶活比初始培养基提高了64.6%。

罗跃中等[16]对诱变后的黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶的培养基组成及发酵条件进行了优化，得到最适培养基为：米糠20 g·kg-1，碳源玉米粉60 g·kg-1，氮源硝酸铵5 g·kg-1，MnCl2 4 g·kg-1；最适条件为：料液比1.0∶1.5(g∶mL)，初始pH值7，接种量6 mL·(100 g)-1，40 ℃、180 r·min-1下发酵72 h，摇瓶产酶达到1 120.0 U·mL-1，比基础培养基提高了近2.9倍。

詹深山等[17]以黑曲霉为出发菌株，以提油后的麻疯树饼粕为培养基，采用固态发酵产蛋白酶，控制培养基湿度为50%，添加5%的葡萄糖作为碳源,在此条件下发酵4 d，蛋白酶产量达到最大值9 204 U·g-1。

de Almeida等[18]采用响应面法对黑曲霉ATCC 16404进行产蛋白酶条件优化。研究表明，在底物湿度48%、底物含量 35%、接种量0.18%、反应时间4 d、反应温度30~45 ℃下，酶活力最高达到144.49 U·g-1。