植物种质的超低温保存
14 植物种质保存
在-80以下的超低温下保存的方法。
种质保存的意义
随着经济发展，地球不断开发及生态环 境破坏，每年都有多个物种消失或濒临 灭绝。各种植物，是植物品种改良乃至 农业可持续发展的基础。它们是经过长 期进化而来，一旦失去不会再来。
种质保存的方法
按保存的地理位置分
：原地保存和异地保存
原地保存:在原来的生态环境条件下就地保存，如建立 自然保护区 ，天然公园等；
四解冻与再培养
超低温保存效果与化冻速度有密切关系，不同
的材料应采用不同的化冻方式。
液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采 用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般 需要采用慢速化冻法。
生长季节中的材料，一般在37-40度温水浴中快速化 速比在室温下缓慢化冻要好，而木本植物的冬芽，在 超低温保存后，必须在0度低温下进行慢速化冻才能
二、低温下细胞致死损伤
细胞超低温贮存一般要经过：
预冻---超低温长期贮存---解冻
细胞致死损伤一般发生在预冻和解冻两
个环节上
避免细胞致死损伤是超低温保存技术研
究的重点
二 分级冷冻
两步冰冻法 分级冰冻法
两步法：
第一步：降温至转移温度。样品在添加冰 冻保护剂后，用可控速率的降温设备（程 序降温仪），以某个速率将样品降温至转 移温度（一般为-40至-70）。
第二步：将处于转移温度下的样品置于液
氮贮存。
逐级冰冻法： 将经保护剂处理的材料在0度预处理后，依 次通过不同温度的冰浴，如-10，-15，-23， -40等。一般每级约停留5分钟，然后浸入 液氮。
三、玻璃化冻存
玻璃化（vitrification）:指液体转变为非晶体 （玻璃态）的固化过程。
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
(种子学课件)种子超低温贮藏
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
药用植物种质资源的超低温保存
·综述·△［基金项目］ 广西科技计划项目（桂科ＡＤ１７２９２００４，桂科ＺＹ１９４９０２３）；广西壮族自治区药用植物园创新团队项目（桂药创２０１９０１１）［通信作者］ 缪剑华，研究员，研究方向：药用植物保育学；Ｅ ｍａｉｌ：ｍｊｈ１９６２＠ｖｉｐ １６３ ｃｏｍ药用植物种质资源的超低温保存△李翠，陈东亮，陈晓英，雷明，郭晓云，缪剑华广西壮族自治区药用植物园／广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 ５３００２３［摘要］ 药用植物种质资源是发展中医药的特有野生生物资源和战略生物资源，药用植物种质资源的保存至关重要。
原位保存和离位保存是药用植物种质资源的主要保存方法，超低温保存是迄今为止最为安全、经济、有效的药用植物种质资源离位保存方法。
本文从超低温保存的原理及优势、材料的选择和预处理、保护剂的使用、化冻方法及药用植物超低温保存现状进行总结综述和展望，提出药用植物超低温保存研究应以遗传稳定性为首要考察指标并逐步与生产实践相结合。
［关键词］ 药用植物；种质资源；超低温保存；原理［中图分类号］ Ｒ２８２ ２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７３ ４８９０（２０２０）０６ ０９６６ ０５ｄｏｉ：１０ １３３１３／ｊ ｉｓｓｎ １６７３ ４８９０ ２０１９０８０７００１ＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＬＩＣｕｉ，ＣＨＥＮＤｏｎｇ ｌｉａｎｇ，ＣＨＥＮＸｉａｏ ｙｉｎｇ，ＬＥＩＭｉｎｇ，ＧＵＯＸｉａｏ ｙｕｎ，ＭＩＡＯＪｉａｎ ｈｕａＧｕａｎｇｘｉＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔｓ，ＧｕａｎｇｘｉＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３００２３，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＧｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓａｒｅｕｎｉｑｕｅｗｉｌｄｌｉｆｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｓｔｒａｔｅｇｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓｉｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｔｈｅｍａｉｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｒｅｉｎ ｓｉｔｕｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｉｎ ｓｉｔｕｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｂｙｆａｒ，ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｓｔｈｅｍｏｓｔｓａｆｅ，ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｘ ｓｉｔｕｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄａｄｖａｎｔａｇｅ，ｍａｔｅｒｉａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｕｓａｇｅ，ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ，ｆｒｅｅｚｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｒｅａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ Ｆｉｎａｌｌｙ，ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｓｈｏｕｌｄｂｅｔａｋｅｎａｓｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｉｎｄｅｘｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｕｌｄｂｅｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｒａｃｔｉｃｅｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅ；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ长久以来中药用传统方式为世人健康服务，其需求量正随着人们对健康生活需求的提升而不断增长。
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法有以下几种：
1. 冷冻保存：将种子、胚胎、胚乳、芽等种质资源放入低温环境中进行保存，常见的冷冻保存方法包括液氮冷冻、超低温冷冻等。
2. 冷谷保存：将种质资源放入干燥的低温环境中保存，例如在干燥剂中保存。
3. 真空保存：将种质资源放入真空中进行保存，可以减少氧气的作用，减缓种质资源的老化和分解。
4. 无菌保存：将种质资源置于无菌条件下进行保存，防止微生物的污染和传播。
5. 酶处理保存：通过添加酶来保护种质资源，例如添加抗氧化酶来延缓氧化反应，添加脱水酶来抑制水分的作用等。
6. 组织培养保存：将种质资源进行组织培养，使其在人工培养基上生长和繁殖，以便长期保存。
7. 动物胚胎冻存：将种质资源保存在胚胎的形态中，通过冷冻来延长胚胎的存活时间，从而保存种质资源。
以上是常见的种质资源保存方法，不同的种质资源和保存目的可以选择适合的方法进行保存。
种质资源的超低温储藏研究进展
［ ２ 姚小华 ， １］ 王开 良， 庄瑞林 ． 图说油茶高效生态栽培 ［ ． 州： Ｍ］杭 浙江 科学技术出版社 ，０ ９ ２０ ． ［ ３ 姚小华 ， １］ 王开 良， 细芳 ， 我国 油茶 产业化 现 状及 发展 思路 罗 等． ［ ］ 林业科技开发 ，０ ５，９ １ ：＿ ． Ｊ． ２ ０ １ （ ）３ ６
［ ］ 北京 ： Ｊ． 中国林业科学研究院 ， ０ ． ２ ０ ０
［ ７ 庄瑞林 ， １］ 陈炳章． 中国主要油茶物种 的脂 肪酸含量［ ］ 植物生理 Ｊ．
学 通 讯 ，９ ５ ２ ：６ ２ ． １ ８ （ ）２ － ８
（ 责任编辑
葛华 忠）
种质 资 源 的超 低 温 储 藏 研 究 进 展
［］ ８ 韩宁林 ， 赵学 民． 油茶高产品种栽 培［ ． Ｍ］ 北京 ： 中国农业 出版社 ，
２０ ０ ９．
同 ， 的高 达１ ．％ （ 般 为 １％左 右 ） 因此 ， 鉴 有 ９５ 一 ０ 。 选 亚油 酸含量 高 和脂肪 酸组成 配 比好 的优 良无性 系 ， 可 提高油 茶 品 质 ¨ ” 。 同 时 ， 开 展 油 茶 杂 交 育 种 工 Ｊ 要 作， 选育 特异 的 油茶 良种 。从 我 们 过 去 的 实践 来 看 ， 能 够较快 得到 优 良 Ｆ １代 ， 即可 繁殖 利 用 。这是 一 项 长 期而 又有价 值 的工作 ， 必须 坚 持下 去 。
营 论 综 述
６７ｍ 以上的优 良 ６ 无性系的选鉴和繁育推广工作 ， 使 油茶产量翻番 ， 使油茶 良种化程度更上 一层楼 ， 实现 良种高产 的水 平 。 ・ 第 四 ， 强 具 有 高产 基 础上 优 质 高 抗 良种 选 育 。 加
据 １９ － １９ ９ ２ ９ ４年对 １０个 优 良无性 系脂 肪 酸组 成 的 ５ 测定 中发 现 有 ２ Ｏ多 个 优 良无 性 系 的亚 油 酸 含 量 不
种质资源库的保存方法
种质资源库的保存方法植物种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。
设施保存的场所又称种质资源库，英文意译为”种质银行“，是当前最有效、最安全的保存方式，它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法。
种质库保存以种子为主体的作物种质资源及其近缘野生植物，这些材料可随时提供给科研、教学及育种单位研究利用及其国际交换。
种质库在接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入-18℃冷库。
入库保存种子的初始发芽率一般要求高于85%，种子含水量降至5%～6%。
根据科学家估算，在上述贮藏条件下，一般作物种子寿命可保存50年以上。
型号：TPZY-C林木种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。
设施保存的场所又称林木种质资源库或林木种子标准样品库，英文意译为”种质银行“，是当前最有效、最安全的保存方式，它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法。
种质库保存以种子为主体的作物种质资源及其近缘野生植物，这些材料可随时提供给科研、教学及育种单位研究利用及其国际交换。
种质库在接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入-18℃冷库。
托普仪器已为广大科研院校、教育及育种单位研发建设的林木种质资源库，助力种质资源保存工作。
托普林木种质资源库主控系统功能：1.全新动态恒温恒湿控制系统，响应快，精度高。
2.任意设定的温度、湿度控制参数，自动构成局部的微气候环境。
触摸屏尺寸不小于5.7英寸,所有的参数显示和设定均可在触摸屏上进行，在全彩色触摸屏上进行参数设置等操作的功能，可根据种子种类的不同选择最佳制冷或除湿的运行模式，可在触摸屏上直接设置温度，湿度，时间，模式等参数, 具有实时温湿度，历史温湿度数据曲线，设备运行状态显示，故障图形代码显示等专用功能。
3.整个控制系统具有计算机通讯接口，如有需要可以安装上位机软件对整个控制过程进行全程监控，对库房的的温湿度数据进行电脑数据显示、曲线显示、数据记录以及打印等。
药用植物种质资源超低温保存研究
及降温速度有关 ， 一般可通过提高 降温速率 和增加 溶 液浓度 实现溶 液 的玻璃 化 ｌ ． 常 ， 玻璃化 形 成 － 通 ４ 】 在
过程 中 ， 有 因冰 晶 的形 成 而对 细 胞 造 成 的机 械 损 没
植 物组 织结 冰 分 为胞 外 结 冰 和胞 内结 冰 两 种 。
伤． 因此 ， 玻璃化法超低温保存是依据此原理， 在快 速降温的同时采用高浓度复合保护剂即玻璃化溶液 弱化水结晶以使溶液呈过冷状态， 从而使细胞内外溶
０ 引 言
我 国是 药用 植 物 资源 极 为 丰 富 的 国家 之 一 ， 据 调查 ， 目前 我 国共 有 中药 资 源 １ ０ ２８７种 ， 中药 用 其 植物 １ ４ １１６种 ， ８ ．３ 占 ７ ｏ ％… ． 随着 经 济 的发 展 ， 人 们对药 用植 物资 源 的需 求 量 与 日俱 增 ， 用 植 物 资 药
通常将 一８ Ｏ℃以下的温度称为超低温 ． 超低温
冷 冻 保 存 一 般 以 液 氮 为 冷 源 ， 温 度 维 持 在 使
一
１６ｏ左 右 ． 理 论 上 分 析 ， 物 材 料 在 此 温 度 ９ Ｃ 从 生
下， 其活细胞内的新陈代谢 和生长活动几乎完全停
止 ， 于“ 处 生机 停顿 ” 态 ， 而能 够有效 保持 生物 材 状 从
是 面临着灭 绝 的危 险 ． 因此 ， 药用植 物种 质资 源实 对 施有效 地保 护 已是一项 十 分紧迫 的任 务 ．
及 蛋 白质 变性 等伤 害 ． 冷冻 降温过 程 中 ， 多植 物 在 许 细胞 对低 温下 细胞外 结 冰具 有 一定 的耐 受力 ． 是 但 如果 植物 细胞 内的水 结 冰 ， 晶在形 成 和融 化 时会 冰 对 细胞 产 生直接 的机 械 破 坏 作 用 ， 得 细 胞 结构 的 使
超低温冷冻保存种质
植物种质的超低温保存
超低温冷冻保存种质
• 是指利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有 的遗传物质保持其完整性，有高的 活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去。
按保存类型分类
按保存类型分类可分为两种类型
非原生境保存
原生境保存
超低温冷冻保存种质
超低温冷冻保存种质
• FDA、TTC等染色的方法进行快速检测， 只能作为生活力的预测指标
超低温保存技术的发展
1973年科学家首次成功地超低温保存 了 胡萝卜悬浮细胞。
1993年，英国国家种质库采用超低温保存 离体的苹果种质进行再培养成功。
超低温冷冻保存种质
• 悬浮细胞和愈伤组织的保存 • 生长点冷冻保存 • 胚状体（体细胞胚、花粉胚）冷冻保存 • 原生质体冷冻保存
超低温冷冻保存种质
a、快速解冻法 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃
温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度 为500—750℃/min。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻， 再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
超低温冷冻保存种质
• 检验化冻后材料的生活力和存活率的最 根本方法是再培养。
费用高，易受到自然灾害的影响
超低温冷冻保存种质
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害 的影响，不受季节限制。短时间可实现大量 植物的增殖，无病毒。
缺点：连续不断的继代培养可能会引起染色 体和基因型的变异。
种质资源超低温保存是将植
物的细胞或组织经过Байду номын сангаас冻处 理后, 在液氮超低温- 196℃ 下保存的方法。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
◆分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱
种质资源保存方法
种质资源是亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代决定其性状的遗传物质，是生物遗传变异和生物多样性的物质基础，是新品种选育和改良的遗传物质基础。
种质资源的保存以种子形式保存方法为佳，此法具有最经济并能保持稳定的遗传性等优点。
种质资源保存方法主要有以下几种：1.干燥密封保存：在常温条件下在密封容器中加适量干燥剂保存种子的方法。
干燥剂可用生石灰、氯化钙、硅胶等，一般种子与干燥剂的比例以1∶2为宜，硅胶比例可适当提高。
2.低温保存：种子干燥后进行密封包装，然后置于低温条件下如冷库、冰箱内保存。
这是一种低温不控湿度的方法。
因此特别要注意存放种子的容器要严格密封，防止吸湿。
3.异地保存：将潮湿地区的种子移至到干燥、低温地区保存。
我国青海、新疆等地气候干燥寒冷，青海西宁常年平均气温6.0℃，平均相对湿度为53.9%，7月至9月的相对湿度在65%左右，即相当一个自然低温干燥库。
以上保存方法其共同特点是，种子含水量仍相对较高。
种子在贮藏中代谢仍比较旺盛，种子衰老快，种子温度常随外界环境的变化而变化，如密封不好，种子含水量还会与环境湿度平衡。
4.种质库保存：种质库库内有控湿设备，是当今保存种质资源较为理想的条件。
按贮藏期可分为短期保存，中期保存和长期保存三种。
短期库：库温控制在10℃~15℃，相对湿度在50%~60%。
种子用纸袋或布袋包装，一般可存放5年左右，作为临时应用材料，供鉴定、研究和分发。
中期库：库温0℃~10℃，相对湿度在50%以下。
种子用防潮材料包装并密封。
种子水分在8%左右，可保存15以上，保存种子主要是用作分发材料。
长期库：库温在-10℃~-20℃，相对湿度在30%~50%，种子含水量在4%~6%。
种子用铝盒或铝箔塑胶密封包装、或真空密封。
贮藏期50年~100年。
长期库贮藏，一般不作分发用，即当分发材料用完时可用作繁殖材料提取，所以也叫基础库。
复份异地保存：因为全部种子资源集中一处保存有很大危险性，为了防止万一，从种子中分出一部分，放置另异地进行复份保存，此种保存法称复份异地保存。
种质资源保存方法
种质资源保存方法种质资源保存是指通过某种方式将植物、动物或微生物的遗传信息保存下来，以供未来利用。
种质资源的保存对于农业、畜牧业、渔业、草业和微生物资源的研究和利用至关重要。
在世界各地，种质资源保存已经成为保护生物多样性和可持续发展的重要措施之一。
种质资源保存方法有多种，包括冷冻冷藏、冷冻干燥、显微冻干、液态氮冻存、遗传变异保存和活体保存等。
下面将对几种常见的种质资源保存方法进行详细介绍。
1. 冷冻冷藏：冷冻冷藏是一种经济、简单且广泛应用的种质资源保存方法。
它利用超低温条件将种子、胚胎、花粉或细胞等种质资源冷藏保存，减缓其新陈代谢过程，从而延长其保存寿命。
冷冻冷藏通常在零下18至零下196的冷库中进行。
由于在冷冻过程中可能出现冰结晶的问题，因此在保存前需要对种质资源进行预处理，如加入保护剂、脱水或将其包裹在冷冻保护胶中。
2. 冷冻干燥：冷冻干燥是一种将水分从种质资源中去除的方法。
它通过将种子或胚胎置于低温下，然后将其暴露在低压环境中，使水分以固体的形式从种质资源中转变为气态，达到干燥的效果。
冷冻干燥可以有效防止冰结晶损伤，同时减缓种质资源的新陈代谢速度。
冷冻干燥需要高度精确的设备和操作技术，因此在实践中相对较少使用。
3. 显微冻干：显微冻干是一种将种质资源在显微镜下进行冻干的方法。
它使用显微镜将种质资源放置在微小观察盒中，然后将其冷冻并暴露在低压环境下进行干燥。
显微冻干可以保持种质资源的原始形状和结构，避免了冻干过程中可能出现的形变和损伤。
这种方法主要适用于细胞和微生物等微小种质资源的保存。
4. 液态氮冻存：液态氮冻存是一种将种质资源置于极低温度下保存的方法。
液态氮的温度为零下196，是一种非常冷的物质。
液态氮冻存可以有效地保护种质资源，防止其发生任何生物、化学或物理变化。
液态氮冻存被广泛用于保存胚胎、细胞、酵母菌、昆虫等种质资源。
5. 遗传变异保存：遗传变异保存是指通过人为调控和利用种质资源的遗传变异来保存这些资源。
果树种质资源超低温保存研究进展
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中 图分 类 号 ： ￥ ６ ６ ０ ． ２ 文献标识号 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ９ ４ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ １ ２ ２— ０ ５
Ａｄ ｖ ａ ｎ ｃ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ０ ｆ（ ： ｒ Ｖ ０ ｐ ｒ ｅ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ０ ｎ ０ ｆ
植物材料超低温保存方法
植物材料超低温保存方法摘要：一、引言二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性2.细胞内生物大分子的稳定性3.细胞器的稳定性三、超低温保存方法的步骤1.样本处理2.低温预处理3.快速冷冻4.低温储存四、超低温保存方法的优点1.保存时间长2.保存条件简单3.保存材料活性高五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织2.动物组织3.微生物六、注意事项1.低温设备的选用2.冷冻速度的控制3.储存条件的维持七、结论正文：一、引言随着科学技术的不断发展，植物材料超低温保存方法在生物学、农业科学等领域具有重要意义。
这种方法可以长时间保存植物材料，保留其生物活性，为科学研究和农业生产提供了有力保障。
二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性：超低温保存方法可以保持细胞膜的完整性，避免细胞内容物泄漏。
2.细胞内生物大分子的稳定性：低温条件下，生物大分子如DNA、蛋白质等结构稳定，功能完好。
3.细胞器的稳定性：超低温保存方法有利于细胞器的结构和功能保持不变。
三、超低温保存方法的步骤1.样本处理：首先对植物材料进行切片、涂片或粉末处理，以便于后续操作。
2.低温预处理：将处理好的样本放置在4℃条件下，进行低温适应。
3.快速冷冻：将预处理好的样本迅速置于液氮中，快速降低温度。
4.低温储存：将冷冻后的样本放入-196℃的液氮中，长期储存。
四、超低温保存方法的优点1.保存时间长：超低温保存方法可以延长植物材料的保存时间，有利于长期研究。
2.保存条件简单：只需低温设备和液氮，无需复杂设备和技术。
3.保存材料活性高：低温条件下，细胞器和生物大分子保持活性，有利于后续实验研究。
五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织：适用于各种植物组织的超低温保存，如叶片、茎尖等。
2.动物组织：适用于动物组织样本的超低温保存，如胚胎、肌肉等。
3.微生物：可用于微生物菌株的超低温保存。
六、注意事项1.低温设备的选用：选择合适的低温设备，确保样本在低温条件下得到有效保存。
种质资源库的保存方法
种质资源库的保存方法植物种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。
设施保存的场所又称种质资源库，英文意译为”种质银行“，是当前最有效、最安全的保存方式，它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法。
种质库保存以种子为主体的作物种质资源及其近缘野生植物，这些材料可随时提供给科研、教学及育种单位研究利用及其国际交换。
种质库在接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入-18℃冷库。
入库保存种子的初始发芽率一般要求高于85%，种子含水量降至5%～6%。
根据科学家估算，在上述贮藏条件下，一般作物种子寿命可保存50年以上。
型号：TPZY-C林木种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。
设施保存的场所又称林木种质资源库或林木种子标准样品库，英文意译为”种质银行“，是当前最有效、最安全的保存方式，它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法。
种质库保存以种子为主体的作物种质资源及其近缘野生植物，这些材料可随时提供给科研、教学及育种单位研究利用及其国际交换。
种质库在接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入-18℃冷库。
托普仪器已为广大科研院校、教育及育种单位研发建设的林木种质资源库，助力种质资源保存工作。
托普林木种质资源库主控系统功能：1.全新动态恒温恒湿控制系统，响应快，精度高。
2.任意设定的温度、湿度控制参数，自动构成局部的微气候环境。
触摸屏尺寸不小于5.7英寸,所有的参数显示和设定均可在触摸屏上进行，在全彩色触摸屏上进行参数设置等操作的功能，可根据种子种类的不同选择最佳制冷或除湿的运行模式，可在触摸屏上直接设置温度，湿度，时间，模式等参数, 具有实时温湿度，历史温湿度数据曲线，设备运行状态显示，故障图形代码显示等专用功能。
3.整个控制系统具有计算机通讯接口，如有需要可以安装上位机软件对整个控制过程进行全程监控，对库房的的温湿度数据进行电脑数据显示、曲线显示、数据记录以及打印等。
作物种子超低温保存方法的构建
种 质 资 源 是 人 类 极 其 珍 贵 的 财 富 。随 着 经 济 发 展， 地球 不 断 开 发及 生态 环 境 破 坏 ， 年 都 有 多个 物 每
种 消失或 濒 临灭绝 。各 种植 物 ， 包括 栽 培种 、 生种甚 野
１６ｏ 。生 物材 料在 如此 低温 下， 陈代 谢活 动 基本 停 ９ Ｃ 新 止， 于“ 处 生机停 顿 ” Ｓ ｓａ ｄｄａ ｉ ａｉｎ 状 态网 这 就 （ｕｐ ｎ ｅ ｎｍ ｔ ） ｏ 。 有 可能极 大 地延 长储 藏种 子 的寿命 ，而不产 生遗 传变 异 ， 而 有效 地 、安 全 地 长期 保 存那 些 珍 贵稀 有 的种 从 质 。 利用 液 态氮保 存 植物 种质 ， 冻容 器就 是液 氮罐 ， 冷 除了 ３ ０～６ 补充 一次 液氮外 ， 要 机械 空调 设备 ０天 不需 及其 它 管理 ， 省 了大量 的人力 和物 力 ， 且 可 以保持 节 并 被保 存组 织及 细胞 培养 物 的遗传 稳 定性 ， 是一 种省 时 、 省工 、 费用 的种 质超 低 温保存 新技 术Ｉ ５ 当解 冻后 ， 省 ３１ 。 能够 恢复 再生 能力 。 种 子的发 芽率 和活 力指 数是 种 子活力 的重 要指 标 之一 ｆ 。冷冻 方 式和解 冻 方式 是影 响种子 超低 温贮 藏 ５ Ｉ ｑ 效 果最 重要 的两个 因素 。为此 ， 试验 选用稀 有作 物豆 本 类、 麦类 、 粟类 中的红小 豆 、 荞麦 、 谷子 为材料 ， 定经过 测
・
种 号 ： ３ ． ２ Ｓ３ ９３ ＋ 文献标志码 ： Ａ
・ 实验研 究 ・
文 章 编 号 ： Ｏ ５ ２ ９ （０２ ０ — ０ ７ ０ １ ０ — ６０ ２ １ ）９ ０ ２ — ４
作物种子超低温保存方法 的构建
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（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
（三）基本程序
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
（二）关键问题及解决措施
• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
离体种质保存的优点
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： ✓ 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； ✓ 植物材料的脱水温度和脱水时间。
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 • 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
液氮
（三）基本程序
• 4、化冻操作 • 快速化冻：适用于大多数材料 • 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 • （5、去除冰冻保护剂） • 6、化冻材料的活力检测： • 根本方法：再培养
THE END
第十章 植物种质的超低温保存
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
繁殖； • 避免自然灾害引起的种质丢失。
二、超低温冰冻保存技术
（一）原理
• 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。
• 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的 长期保存方法。
转移温度
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
玻璃化法
– 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织；
– 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高）
– 大小：适宜
（三）基本程序
• 2、材料的预处理
– 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO