实验四 腹水型单抗的制备及纯化
单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。
常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。
1、二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2、过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。
3、混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。
二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1）饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。
临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。
（2）盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐常用柱层析或透析法。
柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。
第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。
透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。
单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
1，腹水少或者无腹水产生
①致敏不正确，不正确的使用致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久，一般是7-14天，具体看小鼠的腹部情况。
②杂交瘤细胞或者致敏剂的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。
③接种的杂交瘤细胞数量太少，太多或者细胞状态不好。
一般不50万个细胞左右为宜。
④建议使用母鼠或者生育过的母鼠制备腹水。
2，腹水没有效价
①制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。
②致敏小鼠时采用了错误的致敏剂。
③接种的杂交瘤细胞数量太少，或者细胞状态不好。
④由于注射方式和部位错误，形成了实体瘤。
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
杂交瘤腹水纯化方法
杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。
以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。
2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。
3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。
将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。
4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。
洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。
5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。
6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。
需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。
在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
单抗制备过程
动物的选择与免疫1. 动物的选择：纯种BALB/C小鼠2. 免疫方案：根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
细胞融合（1）主要试剂的配制a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。
b、氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）: 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。
过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
单抗纯化主要工艺步骤
单抗纯化主要工艺步骤单抗纯化，这可真是个有趣又充满挑战的事儿啊！首先呢，细胞培养这一步就像是给单抗准备一个舒适的家。
得让细胞们在合适的环境里好好生长，大量繁殖，这样才能产生足够多的单抗呀。
就好像农民伯伯精心照料庄稼，期待着丰收一样。
然后就是收集啦，这就像是把成熟的果实摘下来。
把含有单抗的培养液收集起来，可不能有一点马虎，要把好东西都留下来。
接下来，过滤可就重要啦！这就好比是把杂质筛出去，只留下我们想要的单抗精华。
把那些大大小小的杂质都挡在外面，让单抗能够纯净地展现在我们面前。
再说说层析吧，这可真是个神奇的步骤。
就像是一个超级分拣员，能把不同的物质分开。
单抗在这里就会乖乖地找到自己的位置，和其他杂质说拜拜啦。
还有超滤浓缩呀，这就像把精华进一步提炼，让单抗变得更加纯粹和浓郁。
把多余的水分去掉，让单抗更加集中。
你想想看呀，如果这些步骤没做好，那得到的单抗能纯吗？能好用吗？那肯定不行呀！所以每个步骤都得认认真真，不能有一点马虎。
在单抗纯化的过程中，每一个工艺步骤都像是一场战斗，我们要和杂质战斗，要和不确定性战斗。
但只要我们用心去做，就一定能取得胜利，得到我们想要的纯净单抗。
这就好像是一场精彩的表演，每个步骤都是一个精彩的节目。
细胞培养是开场舞，热闹而充满活力；收集是精彩的独唱，把重点展现出来；过滤是优美的舞蹈，把不好的都剔除；层析是神奇的魔术，让单抗各归其位；超滤浓缩是最后的高潮，把精华展现得淋漓尽致。
单抗纯化的主要工艺步骤，可不只是一些简单的操作，它们是一门艺术，一门需要我们用心去钻研、去实践的艺术。
只有这样，我们才能在单抗纯化的道路上越走越远，为医学事业、为人类的健康做出更大的贡献。
你说是不是呢？反正我是这么认为的呀！。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。
下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。
免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。
2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。
使用无菌器具，注意操作过程要无菌。
3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。
然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。
4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。
浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。
浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。
5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。
亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。
6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。
可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。
洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。
7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。
这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。
8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。
在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。
以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。
根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。
另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。
单抗的制备、纯化和鉴定
单抗的制备、纯化和鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
腹水的制备
这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。
2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。
3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。
4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。
我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。
有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。
还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。
我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。
制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗，也被称为抗体药物，是一种能够识别和结合特定分子的抗体衍生物。
制备单抗的过程通常涉及从动物源中获得特异性抗体、制备抗原以及进行抗体组装和纯化等步骤。
下面是单抗制备的详细步骤：第一步：抗原选择与制备抗原是单抗开发的基础，因此抗原选择至关重要。
一般来说，抗原可以是多肽、蛋白质、细胞表面蛋白或其他重要的识别物质。
抗原的制备可以通过合成化学方法或从相关生物样本中提取制备。
第二步：免疫化学动物一旦获得了抗原，下一步是选择合适的实验动物，并进行免疫化学动物。
常见的实验动物包括小鼠、兔子、狗、大猩猩等。
免疫化学动物的目的是刺激动物的免疫系统产生特异性抗体。
第三步：抗体筛选与克隆在动物体内完成免疫程序后，需要收集动物的血浆或脾细胞等样本，进行抗体的筛选和克隆。
常用的抗体筛选方法包括ELISA、免疫磁球分离等。
选出具有高效结合抗原且具有特异性的单克隆抗体细胞，并将其单克隆化。
第四步：抗体生产与纯化一旦获得了单克隆抗体细胞，接下来就需要进行大规模的抗体生产。
最常用的方法是将单克隆抗体细胞悬浮于培养基中，并使用细胞培养技术进行大规模培养。
培养时间可以根据需要进行调整，通常需要数天至数周。
之后，可以通过离心、滤过等方法收集抗体，然后进行纯化。
第五步：抗体表征为了确保获得的单克隆抗体质量良好，需要进行抗体的表征。
常用的表征方法包括西方印迹分析、免疫组化等。
这些方法可以检验抗体在特定条件下的表达水平、特异性和亲和力等相关特性。
第六步：药物开发与临床研究一旦获得了具有良好特性的单克隆抗体，接下来就可以进行药物开发和临床研究。
在这个阶段，需要进行药物的安全性和疗效评估，以及大规模生产和制药工艺的优化。
单抗制备是一个复杂而严谨的过程，涉及到多个步骤和技术。
制备出高质量的单抗药物对于疾病治疗和生物医学研究具有重要意义。
随着技术的不断进步，单抗制备的效率和质量将不断提高，为医药领域带来更多机会和挑战。
11.7小鼠腹水纯化
2．方法：
1、把小鼠腹水和binding buffer按1：2或者更高的比例混合，之后用0.45um滤膜过滤。
2、把填料小心的装入合适的柱子中，等待大约30min填料就会沉淀好。
3、用binding buffer平衡柱子直至平衡，测流出液体的pH值为9.0，流速设置为1.00ml/min
4、加入处理好的样品，此时要把流速设置为0.5ml/min
5、继续用binding buffer洗脱杂蛋白直至平衡。
6、用elution buffer洗脱目的蛋白，待等到目的蛋白波峰出现时立即收集。
7、使用洗脱液洗脱柱子直至平衡
8、使用保存液（不含叠氮钠）洗脱直至平衡
9、取出填料用含有叠氮钠的保存液4℃保存。
试验结果
1．纯化得到纯抗体
2．
3．
4．
5．
试验分析
问题分析
1．
2．
3．
4．
5．
结果分析
1．
2．
3．
4．
5．
试验进一步设计方向
问题解决设计
1．
2．
3．
4．
整体试验设计
1．
2．
3．
4．
备注说明
试验记录整理说明：
1．学生每天试验务必进行试验记录，并进行规范整理；此工作为实验进行过程中的例行工作；
2．试验目的、方法应与试验日期当天记录整理；试验结果、试验分析和试验进一步设计应予试验完成后及时记录整理；
试验技能训练记录整理表
实验室名称
动物传染病与基因芯片实验室
试验学生姓名
李俊材
试验日期
一种制备单克隆腹水抗体的方法[发明专利]
![一种制备单克隆腹水抗体的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/77bd466e8762caaedc33d41b.png)
专利名称：一种制备单克隆腹水抗体的方法专利类型：发明专利
发明人：李川江
申请号：CN201610327059.0
申请日：20160517
公开号：CN105925539A
公开日：
20160907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种制备单克隆腹水抗体的方法，该方法为将远交系小鼠腹腔注射降脂烷后，接种骨髓瘤杂交瘤细胞，3~7天开始每天采集腹水；采集的腹水立即用离心机离心，放置4℃，次日取出再离心和用虑紙过滤，即可用硫酸氨沉淀、柱层析纯化，获得抗体。
本发明采用远交系小白鼠代替BALB/c小白鼠，用于制备单克隆腹水抗体，该品系小白鼠的优点是繁殖能力强，对饲养条件要求低，价格很便宜，仅为BALB/c小鼠的1/5左右；而且体型较大，对实验耐受性好，因此腹水产量大，是BALB/c小鼠的数倍，抗体效价不低于BALB/c小鼠，而且抗体对温度的稳定性远高于BALB/c 小鼠。
申请人：广东华银医药科技有限公司
地址：510663 广东省广州市经济技术开发区广州科学城揽月路80号广州科技创新大厦创新基地C 区第三层
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
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腹水纯化步骤
腹水纯化步骤腹水是指在腹腔中积聚过多的液体，常见于肝硬化、恶性肿瘤和心力衰竭等疾病。
腹水的存在不仅会给患者带来身体上的不适，还可能导致严重的并发症。
因此，对于腹水的纯化处理非常重要。
下面将介绍腹水纯化的具体步骤。
1. 确定腹水的类型和成因在进行腹水纯化之前，首先需要明确腹水的类型和成因。
腹水的类型包括漏出性腹水和渗透性腹水，成因可能是肝功能异常、恶性肿瘤、心脏病等。
根据不同的类型和成因，选择合适的纯化方法。
2. 给予适当的药物治疗对于某些特定类型的腹水，如渗透性腹水，给予适当的药物治疗可以起到纯化作用。
例如，对于由于肝硬化引起的腹水，可以给予利尿剂和抗生素治疗，以促进尿液的排出和防止感染。
3. 腹腔穿刺引流腹腔穿刺引流是治疗腹水的一种常见方法。
通过穿刺腹腔，将积聚的腹水抽出。
这种方法可以迅速缓解腹胀和不适感，但并不能彻底解决腹水问题。
4. 腹水纯化治疗腹水纯化是通过特定的装置将腹水进行过滤和纯化，以去除其中的有害物质和细菌。
常见的腹水纯化装置包括腹腔滤器和腹腔超滤器。
腹腔滤器是一种通过腹腔引流管将腹水引出，经过滤器进行过滤后再回输到腹腔的装置。
腹腔滤器可以去除腹水中的大分子有害物质和细菌，从而改善腹水的质量。
腹腔超滤器则是一种通过超滤膜将腹水进行过滤和分离的装置。
腹腔超滤器可以选择性地去除腹水中的水分和溶质，从而实现腹水的纯化。
5. 监测治疗效果和并发症在进行腹水纯化治疗的过程中，需要密切监测治疗效果和可能出现的并发症。
包括观察腹水的量和质量变化、监测患者的生命体征和肾功能等。
如发现治疗效果不佳或出现并发症，需要及时调整治疗方案。
总结起来，腹水纯化的步骤包括确定腹水的类型和成因、给予适当的药物治疗、腹腔穿刺引流、腹水纯化治疗和监测治疗效果和并发症。
通过合理的治疗方案和方法，可以有效地纯化腹水，改善患者的症状和生活质量。
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实验四腹水型单抗的制备及纯化
迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。
本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。
可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。
而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。
材料：
1、成年BALB/c小鼠。
2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水
（或冻存的腹水）。
3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0
NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。
方法：
一、腹水的制备
1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，
0.2-0.3ml/只。
2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。
3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。
将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。
二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗
1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；
2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；
3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；
4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；
5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，
6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。
少数测效价。