疟原虫检验技术
镜疟原虫技术(1)
6
血片制作（取血方法）
• 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴 儿可从拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部 位，待酒精干后，用左手拇指和食指轻轻捻转耳垂边 缘或夹住被检者手指尖稍下方，右手持消毒针，迅速 刺入取血部位1-2mm，不宜过深或过浅。然后用左手大 拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
19
血片制作与染色的注意事项
• • • • 载玻片使用前一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。 厚血膜干燥时不要加热，否则会使疟原虫变形，影响镜检结果。 配制母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时，不要将甲醇接触到厚血膜，否则染色时厚血膜 将不能溶血。 • 冲洗染液时，水流要轻缓，不要冲掉厚血膜。
镜检疟原虫技术
2012.3
1
主要内容
• 血片制作与染色 • 疟原虫形态与鉴别 • 疟原虫镜检
2
血片制作与染色
• 血片制作 • 血片染色
3
血片制作（所需用具）
• • • • • 载玻片 75%的酒精棉球 采血针 记号笔 玻片盒
4
血片制作（血膜的制作）
• 用于检查疟原虫的血涂片有两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜； 一种是将血液涂成圆盘形，称厚血膜。 • 薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。
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血片制作和染色（质量判定标准）
好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血 膜中。 中：薄血膜中，厚血膜好或中。 差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。
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血片制作和染色(质量规范)
好 厚 血 膜 血 片 制 作 质 量 血量 位置 直径 外观 4.0-5.0mm3 玻片右1/3 0.8-1.0cm 圆形，厚膜均匀，边缘 整齐 中 略多或略少 稍偏右 0.7-0.8或1.0-1.2cm 圆形，稍不均，不整齐 差 过多或过少 偏右过多 <0.7或>1.2cm 厚薄不均匀影响着 色
疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。
一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。
玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。
皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。
记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。
（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。
载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。
如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。
用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。
3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。
如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。
二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。
疟原虫检验技术
加强技术研究和应用
加强疟原虫检验技术的研究和应用，提高诊断和治疗水平。
推广普及适宜技术
推广普及适宜技术，降低技术应用成本，提高基层医疗机构的疟疾防治水平。
加强国际合作
加强与国际组织和相关国家的合作，共同推进疟疾防治工作，提高全球范围内疟疾控制的效果。
01
02
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THANK YOU.
谢谢您的观看
从最初的化学预防到现在的综合防控，防控策略不断发展和完善。
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疟原虫检验技术分类
血片染色镜检
通过在显微镜下观察染色血片，检测疟原虫ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种类和数量。
活体染色镜检
利用活体染色剂对患者的血细胞进行染色，然后在显微镜下观察疟原虫的活动情况。
显微镜检查
免疫荧光抗体技术
通过将荧光素标记的抗体与患者血清中的疟原虫抗原结合，然后在荧光显微镜下观察并计数。
优点
直接观察疟原虫形态，定位准确；可同时观察几种不同种类的疟原虫；样品容易获取，操作相对简单；费用较低。
缺点
需要有经验的检验员才能准确识别疟原虫；无法区分死菌和活菌；无法鉴定疟原虫的种类；需要时间较长，无法快速检测。
显微镜检查的优缺点
优点
可以检测出感染疟疾后机体产生的特异性抗体，用于诊断和流行病学调查；可以判断出感染疟疾的时间；样品容易获取，操作相对简单。
缺点
抗体检测存在假阳性或假阴性；无法准确判断抗体的种类和来源；无法判断感染疟疾的种类；血清学检测需要时间较长。
血清学检查的优缺点
可以检测出疟原虫的核酸，具有更高的特异性和灵敏度；可以准确鉴定疟原虫的种类；可以判断出疟原虫的基因型；样品容易获取，操作相对简单。
优点
无法区分死菌和活菌；分子生物学检测需要较高的技术和设备支持；检测费用相对较高；对于样品的质量和保存条件要求较高。
疟原虫检验技术
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断和流行病学调查。
优点
恶性疟原虫免疫荧光染色法
优点
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断、药物治疗监测和流行病学调查等。
原理
以疟原虫特异性DNA片段作为引物，通过聚合酶链反应扩增特异性DNA片段，然后将扩增产物进行电泳分析，以检测疟原虫的存在。
局限性
不同种疟原虫的DNA序列存在差异，因此需要针对不同种疟原虫设计不同的引物。
聚合酶链反应（PCR）
对疟原虫的基因序列进行分析，可了解疟原虫的种群结构、遗传变异和抗药性。
核酸序列分析
分子生物学检验
体外培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊细胞或其它传代细胞系中，进行体外培养，用于分离和鉴定疟原虫。
体内培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊体内，进行体内培养，用于分离和鉴定疟原虫。
流行病学调查
通过对疟疾疫源地进行分析，找出传染源和传播途径，有助于制定针对性的防控措施，控制疫情扩散。
疫源地分析
流行病学调查与疫源地分析
结论与展望
06
疟原虫检验技术的重要性和意义
疟原虫检验技术是疟疾诊断、治疗和防控的关键手段，对于减少疟疾传播、保护人民健康具有重要意义。
疟原虫检验技术的发展和应用，有助于提高疟疾防治效果，降低疟疾发病率和死亡率，为国家和人民节省了大量医疗资源和社会成本。
xx年xx月xx日
疟原虫检验技术
目录
contents
疟原虫检验概述疟原虫检验技术分类各种疟原虫检验技术介绍疟原虫检验技术的应用范围与局限性疟原虫检验的实际应用案例结论与展望
疟原虫检验概述
01
疟原虫检验是指通过实验室手段对患者的血液、组织、排泄物等进行检查，以确诊疟疾感染和评估病情严重程度。
疟疾实验室检查方法
疟疾实验室检查方法疟疾是一种由疟原虫引起的传染病，该病在全球范围内广泛分布，并造成了大量的疾病和死亡。
为了及时准确地诊断和治疗疟疾，实验室检查方法起着至关重要的作用。
本文将介绍疟疾实验室检查的常见方法。
1. 血涂片检查血涂片检查是最常用的疟疾实验室检查方法之一。
该方法通过在玻片上涂抹患者的血液样本，并使用特殊的染色剂染色，然后在显微镜下观察。
疟原虫在血液中的形态特征使其能够与其他细胞区分开来，从而能够准确地诊断疟疾。
血涂片检查的优点是简单易行，结果迅速可靠。
然而，该方法需要经过专业人员的训练和经验，以确保结果的准确性。
2. 快速诊断试纸检测快速诊断试纸检测是一种简便快速的疟疾实验室检查方法。
该方法基于抗原-抗体反应原理，通过在试纸上加入患者血液样本，检测疟原虫抗原或抗体的存在与否。
试纸通常具有几个测试线，每个测试线代表一种疟原虫类型。
根据试纸上测试线的出现情况，可以快速诊断疟疾的类型。
快速诊断试纸检测的优点是操作简单，结果迅速，适用于一线医疗机构和偏远地区的疟疾筛查。
3. 分子生物学检测分子生物学检测是一种高灵敏度和高特异性的疟疾实验室检查方法。
该方法通过提取患者血液中的疟原虫DNA或RNA，然后使用特定的引物和荧光探针进行PCR扩增和实时荧光检测。
分子生物学检测能够检测到非常低浓度的疟原虫，具有高度的准确性和敏感性。
然而，该方法需要复杂的实验室设备和专业人员的操作技术，限制了其在资源匮乏地区的应用。
4. 免疫荧光检测免疫荧光检测是一种基于抗原-抗体反应的疟疾实验室检查方法。
该方法通过在患者血液样本中加入特定的荧光标记抗体，与疟原虫抗原结合形成复合物，然后在荧光显微镜下观察。
免疫荧光检测可以同时检测多种疟原虫类型，并具有高度的特异性和敏感性。
然而，该方法需要昂贵的设备和专业人员的操作技术，限制了其在一线医疗机构和偏远地区的广泛应用。
总结起来，疟疾实验室检查方法包括血涂片检查、快速诊断试纸检测、分子生物学检测和免疫荧光检测。
疟原虫半定量计数方法
疟原虫半定量计数方法引言疟疾是一种由疟原虫引起的传染病，全球范围内仍然存在高发和流行的地区。
因此，准确快速地检测疟原虫的数量对于疟疾的诊断和治疗非常重要。
疟原虫的半定量计数是一种常用的方法，本文将详细介绍该方法的原理、步骤以及优缺点。
二级标题1：疟原虫半定量计数方法的原理三级标题1：荧光显微镜技术在疟原虫半定量计数方法中，荧光显微镜技术是一种常用的方法。
该方法基于荧光显微镜的原理，通过特殊的荧光染料，使疟原虫在显微镜下呈现出特定的荧光信号。
三级标题2：实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术也是疟原虫半定量计数的一种常用方法。
该方法通过PCR扩增疟原虫的DNA，并使用荧光标记探针或SYBR Green等荧光染料进行检测。
三级标题3：流式细胞术流式细胞术是疟原虫半定量计数的另一种常用方法。
该方法通过流式细胞术仪器，将疟原虫样品悬浮于液体中，并通过流式细胞术仪器的检测系统，对疟原虫数量进行快速准确的测定。
二级标题2：疟原虫半定量计数方法的步骤三级标题1：样品处理在进行疟原虫半定量计数之前，首先需要对样品进行处理。
样品处理的步骤包括收集样品、制备样品涂片等。
三级标题2：荧光显微镜技术的步骤荧光显微镜技术的步骤包括染色、显微镜观察、图像分析等。
三级标题3：实时荧光定量PCR技术的步骤实时荧光定量PCR技术的步骤包括DNA提取、PCR扩增、荧光检测等。
三级标题4：流式细胞术的步骤流式细胞术的步骤包括样品制备、细胞染色、流式细胞术仪器的设置和数据分析等。
二级标题3：疟原虫半定量计数方法的优缺点三级标题1：优点•精确性高：疟原虫半定量计数方法可以在很短的时间内准确地测定疟原虫的数量。
•灵敏性好：疟原虫半定量计数方法可以检测低浓度的疟原虫。
•可靠性高：疟原虫半定量计数方法的结果可靠且重复性好。
三级标题2：缺点•依赖设备：疟原虫半定量计数方法需要使用特殊的仪器和设备，增加了成本和操作的复杂性。
•需要专业技术人员：疟原虫半定量计数方法对操作人员的技术要求较高，需要专业培训和经验积累。
疟疾检测指标
疟疾检测通常包括以下指标：
1. 血涂片显微镜检查（Thick and Thin Blood Smears）：这是诊断疟疾最传统的方法，通过在显微镜下观察血液涂片中的寄生虫来确定是否感染疟疾以及感染的种类。
2. 快速诊断试验（Rapid Diagnostic Tests, RDTs）：这种方法使用试纸条来检测血液中特定的疟疾抗原，结果通常在15-20分钟内可获得。
3. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）：PCR是一种高灵敏度和特异性的分子技术，能够检测血液中极少量的疟疾DNA，适用于确诊、监测治疗效果以及疟疾流行病学研究。
4. 免疫荧光技术（Fluorescence-based Antibody Testing）：这种方法通过荧光标记的抗体与寄生虫特异性抗原结合，在荧光显微镜下进行检测，以确定感染。
5. 血清学检测：通过检测血液中针对疟原虫的特异性抗体，可以帮助诊断疟疾，特别是在急性期之后。
疟疾的检测不仅需要准确的实验室方法，还需要综合临床症状和患者的旅行史等信息进行综合判断。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术一、疟原虫的生物学特征疟原虫是一类单细胞真核生物，寄生在人类和其他脊椎动物的红细胞内。
常见的疟原虫种类包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。
疟原虫的生活史包括在人体内的无性生殖和在蚊体内的有性生殖两个阶段。
在人体内，疟原虫经历了肝细胞内的红外期和红细胞内的红内期发育过程。
了解疟原虫的生物学特征对于选择合适的检验方法具有重要意义。
二、疟原虫检验技术的分类1、显微镜检查法这是疟原虫检验的经典方法，包括薄血膜涂片和厚血膜涂片检查。
薄血膜涂片用于疟原虫形态学观察，可鉴定疟原虫的种类；厚血膜涂片则提高了疟原虫的检出率。
在显微镜下，观察疟原虫的形态、大小、细胞核和细胞质的特点，以及疟色素的分布等，从而确定是否感染疟原虫以及感染的种类。
2、免疫学检测法（1）抗原检测利用免疫层析技术检测患者血液中的疟原虫抗原。
这种方法操作简便、快速，适用于现场检测和大规模筛查。
（2）抗体检测检测患者血清中的特异性抗体。
但由于抗体在感染后一段时间才会产生，且抗体检测不能区分现症感染和既往感染，因此在疟疾诊断中的应用相对有限。
3、分子生物学检测法（1）PCR 技术通过扩增疟原虫特定的基因片段来检测疟原虫。
具有高度的敏感性和特异性，能够检测到极低浓度的疟原虫核酸。
（2）核酸杂交技术利用标记的核酸探针与疟原虫核酸进行杂交，从而检测疟原虫。
4、其他检测方法（1）血常规检查疟疾患者可能会出现贫血、白细胞减少等血常规异常。
（2）血生化检查部分疟疾患者可能会有肝肾功能损害，通过血生化检查可以了解相关情况。
三、显微镜检查法的操作步骤1、采血通常采集患者的末梢血或静脉血。
2、制作血涂片薄血膜涂片：将一滴血液滴在载玻片的一端，用推片以 30°－45°角均匀地推成薄而均匀的血膜。
厚血膜涂片：取较多的血液滴在载玻片上，用推片制成较厚的血膜。
3、固定和染色薄血膜涂片自然干燥后，用甲醇固定，然后用吉姆萨染液或瑞氏染液染色。
疟原虫的镜检技术-制片染色
注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染 液的pH值7.0-7.2较好。 染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合， 使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞 和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时， 红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色， 不易观察。
姬氏染液的染色方法
血片干燥后,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）, 再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白(新制作的也可直接染色)，然后 再进行染色。 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 3%姬氏染液稀释液（3毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30-40min（根据当地实际 情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗干净， 将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液2-3滴，加缓冲液 或蒸馏水1ml，混合均匀，染色15-20分钟左右，然后用清水轻轻 将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染 液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检） 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈 蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
染液的种类
疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏 （Wright stain）和姬氏染液（Giemsa stain）。 这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美 蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用姬氏染液，它具有方便，染色效果稳 定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间 短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大 的门诊实验室使用。
染液的染色原理
是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一 种化学反应。 红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出 的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带 的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。 疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟 原虫和白细胞核被染成紫红色。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术1）薄血膜（thin blood film）制作方法（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。
2）厚血膜（thick blood film）制作方法（1）采血同薄血膜法（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。
取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。
厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。
充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。
3）固定、染色（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。
瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。
滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。
4）注意事项(1）玻片要洁净，无油脂。
血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。
血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。
(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。
厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。
(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。
(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。
加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。
冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜。
疟原虫镜检技术培训手册
目录第一章疟原虫生活史一、概述二、人体内发育三、蚊体内的发育第二章疟原虫镜下形态一、薄血膜中疟原虫形态二、厚血膜中疟原虫形态第三章显微镜使用及维护一、显微镜的构造二、显微镜使用三、使用注意事项四、显微镜的维护保养第四章血片制作与染色一、血片制作二、血膜的染色第五章疟原虫镜检技术一、血液二、血液中各种正常细胞形态三、薄血膜镜检四、厚血膜镜检五、杂质与疟原虫的鉴别六、疟原虫计数附录：疟原虫图谱第一章疟原虫生活史一、概述疟原虫是疟疾的病原体。
疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。
人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。
在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。
4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。
疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。
疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。
4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。
二、人体内发育疟原虫在人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。
（一）红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。
成熟肝期裂殖体直径为45～60 m，内含数以万计的肝期裂殖子。
肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。
不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6～12天不等。
疟原虫检验技术
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少
●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
血片染色
两种染色方法: ●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B typ来自) 5g疟原虫人类四种疟原虫的 基 本特征
感染人的疟原虫有四种:
恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale
恶性疟 P.falciparum
● 四种疟原虫中致病力最强 ● 无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治
疗可危及生命 ● 在我国主要流行云南省和海南省
2. 显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视 野（ 300-500红细胞/视野）
3. 按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟 原虫数
4. 如果能见到疟原虫，但是记数5000～10000个红细胞 时却没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
● 检查全部厚血膜未查见疟原虫 ● 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见
感染红细胞边 缘破碎状
薛氏点明显疟 色素棕黄色,类 似间日疟原虫
种
周 围 血 红细胞形态
疟原虫形态
中发育
阶段
大小
点彩
胞浆
疟色素
裂殖子数
恶 性 疟 原 环状体
虫
配子体
正常
常见 茂氏 点
环状体钎细， 常见２个核
粗黑，配子 体中明显
疟疾镜检的实验室技术
疟疾镜检的重要性
疟疾镜检能够快速、 准确地诊断疟疾，为 及时治疗提供依据。
对于疟疾高发地区， 疟疾镜检是监测和评 估疟疾流行情况的重 要手段。
通过疟疾镜检，可以 及早发现疟疾，防止 病情恶化，减少并发 症的发生。
疟疾镜检的历史与发展
疟疾镜检最早可追溯到19世纪末期，当时使用简单的显微镜观察血液样本。
免疫学检测
检测方法
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光抗体试验（IFA）等方法检测血液中疟 原虫抗原或抗体。
检测原理
利用特异性抗体与疟原虫抗原结合的原理，通过显色反应或荧光标记来判断疟原 虫的存在。
03
疟疾镜检的步骤与操作
样本采集与处理
采集时间
选择疟疾感染后红细胞期， 即发热后2-3天采集样本， 此时疟原虫数量最多，检 出率最高。
改进样本处理方法，提高疟原虫 的提取和富集效果，降低背景干
扰，提高检测灵敏度。
特异性抗体标记
利用特异性抗体标记疟原虫，降 低非特异性染色，提高检测特异
性。
基因检测技术
利用基因检测技术，对疟原虫基 因进行检测，提高检测的灵敏度
和特异性。
降低操作复杂度与成本
简化操作流程
优化检测流程，减少操作步骤，降低操作复杂度。
采集部位
通常采集静脉血液，常用 肘静脉或耳垂。
采集量
根据检测需求，一般采集 5-10ml血液。
血液样本处理
离心分离
将采集的血液放入离心管中，以 一定速度离心，使红细胞下沉， 分离出血浆和白细胞层。
制备涂片
用毛细管吸取白细胞层中的疟原 虫，均匀涂在载玻片上，晾干后 进行显微镜检查。
显微镜检查
显微镜类型
镜检过程需要经过多个步骤，包括血液采集、制片、染色和观察等，操作较为复杂。
疟原虫的镜检技术
正确使用显微镜步骤
01
02
03
04
05
将载玻片放在载物台上， 用压片夹固定。
转动转换器，将低倍物镜 对准通光孔。
调节光圈和反光镜，使视 野亮度适宜。
转动粗准焦螺旋，使镜筒 缓缓下降，直到物镜接近 载玻片。
一只眼注视目镜内，同时 逆时针方向转动粗准焦螺 旋，使镜筒缓缓上升，直 到看清物像为止。再略微 转动细准焦螺旋，使看到 的物像更加清晰。
结果判断失误
应结合临床症状和其他检查结果进 行综合判断，避免误诊或漏诊。
06
镜检技术在疟疾防控中应用前景
提高镜检技术准确性和效率
01
02
03
改进显微镜设备
采用高分辨率、高对比度 的显微镜，提高疟原虫检 测的准确性。
优化镜检流程
建立标准化的镜检操作流 程，减少人为因素对结果 的影响，提高检测效率。
05
常见误区及问题解决方法
涂片制作中常见问题
涂片过厚或过薄
染色时间不足或过长
应掌握适当的涂片厚度，过厚会影响 观察，过薄则可能漏检。
应严格控制染色时间，确保疟原虫着 色清晰。
血液未充分干燥
涂片后应等待血液完全干燥，否则在 染色过程中可能导致颜色不均匀。
观察过程中常见问题
02
Hale Waihona Puke 0103显微镜使用不当
100%
流行病学调查
通过对人群进行疟原虫检测，可 以了解疟疾的分布情况、流行趋 势和传播途径等信息，为制定防 治策略提供依据。
80%
药物疗效评价
在治疗过程中进行疟原虫检测， 可以观察药物的疗效和患者的恢 复情况，及时调整治疗方案。
02
镜检技术原理及方法
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血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法
1. 染色原液配制 2. 门诊快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色
●
瑞氏染色法
WHO推荐使用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 甘油 (纯) 甲醇 (纯) 5g 250ml 250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，
三日疟
P.malariae
●遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及 印度部分地区，呈片状、块状分布 ●三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告
卵形疟 （蛋形疟）
P.ovale
●主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告 ●在我国已基本消灭
原虫镜检
血细胞
红细胞 血小板 白细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜 碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）
三日疟（P.malariae）
诊断要点
红细胞不涨大或略小 环状体中等大小，核较大 ，胞浆粗厚 胞浆不活跃呈带状形成熟 滋养体呈菊花状,内含6-12 个裂殖子
雌雄配子体小于正常红细
胞，色素呈深褐色 常可查见各阶段的疟原虫
卵形疟（P. ovale ）
鉴定要点
1. 红细胞正常或 略涨大
者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
135（计数的疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数） =5400 / μl 答：该患者的疟原虫密度为5400 / μl。
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估 算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野 不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1～5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6 ～ 10个虫，记录“++” 5.平均每个视野11 ～ 100个虫，记录“+++ ” 6.平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。 如：Pv R+T++S5G少 这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄 影响，只能定性，不宜作定量分析。
疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点
厚血膜
血量多，面积小，原虫
优点
薄血膜
经甲醇固定，红细胞完 整，原虫形态改变不大，
检出率高
原虫易于辨认
缺点
原虫在干燥过程中皱缩， 血量比厚血膜少许多， 红细胞消失，原虫变形较 但面积是厚血膜的8-10 倍。检查费时，原虫检 大，原虫鉴定困难
出率较低
用途 用于疟疾病人检查 原虫虫种、虫期鉴定及 初学者教学标本
恶性疟
P.falciparum
● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 ● 我国流行区域为云南省和海南省 ● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及 生命（脑型疟）
间日疟
●
P.vivax
遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见
● 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 ● 病程良性, 有复发
时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。
疟原虫镜检
● 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 ● 疟原虫密度计数方法 ● 人体四种疟原虫的形态特征
原虫镜检---金标准
●当前分子生物学、血清学技术快速发展, 但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准”
●显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴 别4种人体疟原虫
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀） 浸没血片，染色30分钟。 （如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间 和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染 色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。
厚血膜溶血染色
放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲 醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进 行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液 染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。
采血部位：耳垂或无名指， 取血方法：通常在耳垂取血， 先用75%酒精棉球消毒取血部位 ，待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方或无名指指 尖，右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。厚血 膜血量约一粒米大小,薄血膜血 量为厚血膜的一半或1/3。
第四步：血片制作
白细胞原虫密度计数法
从血膜的左上角开始，横向。 计数1个视野后，每次间隔5个视野,再计数。
厚血膜
白细胞原虫密度计数方法
× 不需要计数的视野 ● 需要进行白细胞、疟 原虫计数的视野 如果该视野无原虫，则 计数白细胞数
● 看到第一个原虫开始 计数
白细胞疟原虫计数法
●例如 计数200 WBC中有135个疟原虫，在不知患
质量好的染色
显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
偏 酸
外观吉氏染色血片 标 准
偏碱
染色质量影响因素
配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助
于提高镜检质量； 染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随 配随用； 染液的稀释浓度； 染色时间。
疟原虫检验技术
-血片制作、染色及疟原虫形态鉴别
黔东南州疾控中心检验科 潘雪雪
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [P. vivax，P.v] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o] 我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另 二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)
直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加 入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗 ，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 保存时间越长染色效果越好。
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
血片的染色
染色用水和冲洗用水配制
细胞浆：蓝色或深蓝色，随着虫体发育长 大，细胞浆逐渐增多； 核：呈鲜红色，呈圆形或椭圆形。核的结 构致密，只有在个别发育阶段较为疏松， 例如间日疟原虫雄配子体的核。 核
斑点
疟原虫的基本形态特征
疟色素：不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种 类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。 间日疟原虫：呈短棒状，黄褐色； 恶性疟原虫：呈细砂状，黑褐色； 三日疟原虫：呈砂粒状，深褐色； 卵形疟原虫：与间日疟原虫相似。
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法： ● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析 ● 半定量计数法 (厚血膜) 优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析 ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
白细胞原虫密度计数法
镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的 疟原虫数，如果原虫密度较低（200个白细胞中小 于100个疟原虫），可增加白细胞，计数500个。 密度单位:原虫数/μl 计算公式：疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者 每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个 白细胞计数(国际标准) 。
常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水 用pH7.0～pH7.2的缓冲液。
血片染色
薄血膜的固定
厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干
（要点：甲醇不能 触碰到厚血膜）
血片染色
操作1 （快染） 量筒内 量2ml缓冲液(PBSPH7.0) 或净水，直接滴加吉氏原 液7滴，混匀，滴入待染标 本的厚薄血膜上，染色 10min，清水缓缓冲洗，晾 干（血膜朝内面）镜检。 操作2 (慢染) 量筒 内量2ml缓冲液或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀 ，滴入待染标本上，染色 30min。清水缓缓冲洗，晾 干镜检。
疟色素
恶性疟（P.falciparum）
鉴定要点
红细胞不涨大 环状体纤细, 常有多 重感染，环状体内 可有2个核 环状体可贴在红细 胞边缘 除环状体，配子体 外没有其他发育期 配子体呈新月形或 腊肠形 成熟裂殖体约含1632个裂殖子，排列 不规则 可出现茂氏点
21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature.
厚血膜 用推片的一角，从取 血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小）， 使血滴与平置的载玻片接 触，再由里向外一个方向 旋转，转2~4圈，涂成直 径0.8~1厘米大小圆形厚 血膜 薄血膜再取一小滴血.将血置 于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将 推片的边 缘紧贴载玻片，轻轻上下 移动，使血液沿边缘散开， 然后匀速地向前推进，形 成薄而平铺的薄血膜
红细胞
红细胞是双面凹 的圆饼状 边缘较厚，而中 间较薄
血小板
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4
各种血细胞模式图
1.红细胞 2.嗜酸性粒细胞 3.嗜碱性粒细胞
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4.中性粒细胞
5.淋巴细胞 6.单核细胞 7.血小板
疟原虫的基本形态特征
疟原虫基本构造为细胞质(胞浆)、核和疟色素； 原虫：经吉氏或瑞氏染色：核呈红色，胞质呈 兰色，疟色素为本色；
薄血膜
厚血膜
制片过程图示
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