第三章质粒载体PPT课件
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大学优质课课件《基因工程》第三章 基因工程载体
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
5.4 T-载体
6 质粒克隆载体的用途
用于保存和扩 作为核酸杂交时探针的来源。
二、 λ噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分 子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和 解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研 究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点， 已经构建了许料。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
Amp Tet
pBR322
322质粒分子。
5.3 pUC质粒系列
pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其 编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并 不破坏该基因的功能。
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
5.4 T-载体
6 质粒克隆载体的用途
用于保存和扩 作为核酸杂交时探针的来源。
二、 λ噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同分子生物学、分 子遗传学的创立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和 解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研 究成果。依据噬菌体的复制和生活周期等特点， 已经构建了许料。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
Amp Tet
pBR322
322质粒分子。
5.3 pUC质粒系列
pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其 编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并 不破坏该基因的功能。
三质粒与载体ppt课件
Transcription beyond oriV Hybridisation at/near oriV
-445 - 555
RNAaseH cleaves at oriV 2/3 bp accuracy
-445
ONLY 580 bps needed and ONLY 13 after oriV
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
分子量小的(如ColE1质粒)拷贝数高，每个细胞中有10～100个 拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型 质粒(relaxed plasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大 量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（ P202）
质粒的主要类型
质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应
致育因子(Fertility factor，F因子) 抗性因子(Resistance factor，R因子) 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒(virulence plasmid) 代谢质粒(Metabolic plasmid) 隐秘质粒(cryptic plasmid)
质粒编码的两个负调控因子Rop蛋白质和反义RNA (RNAⅠ) ，控制了DNA复制过程中所必需的引物 的合成。
在ColE1复制原点上游方向445 bp处(相当于RNAⅡ 的第111个碱基的位置)处起始转录另一个RNA分子， 其转录方向与RNAⅡ相反，它是由双链DNA链上的 另一条链(C-链)为模板进行转录的，这个RNA分子称 为RNA I，属于反义RNA。
质粒载体的概况及构建 ppt课件
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④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。
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⑤ 筛选时会有三种结果：
一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；
二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；
三是要插入的序列与质粒相连产生白色的抗氨苄青霉素菌 落。
pptቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ件
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THANKS
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（2）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
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（3）可扩增性
• 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的 分裂而稳定地遗传。
• 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨 型复制。
• 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝；
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
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质粒（plasmid）
特点：
能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。 ppt课件
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（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
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质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法 （二）沸水浴法
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（1）碱裂解法
原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏细菌 外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯酚—氯仿 溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。
现代微生物遗传学-第三章质粒课件
质粒在生物能源开发中的应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
质粒在生物能源开发中具有重要作用，可以用于构建高效 生物燃料生产菌株。
质粒可以携带与生物燃料生产相关的基因，将其转移至微 生物中，从而构建出能够高效生产生物燃料的菌株。例如 ，可以利用质粒将油脂合成酶基因转移至酵母菌中，构建 出能够高效生产生物柴油的菌株。此外，质粒还可以用于 提高微生物对光能的利用率，从而构建出能够高效生产太 阳能的微生物。因此，质粒在生物能源开发中具有重要作 用。
详细描述
20世纪60年代，科学家们开始对质粒进行更深入的研究，探索其复制机制和遗传特性。他们发现质粒可以在细菌 细胞内独立于染色体复制，并且可以在不同细菌之间转移和遗传。这些发现为后来的基因工程和分子生物学研究 奠定了基础。
质粒的遗传学研究
总结词
质粒的遗传学研究涉及到多个方面，包括质粒的复制、转录、表达以及质粒与宿主细胞 的相互关系等。
代谢能力
质粒携带的基因可以影响细菌的 代谢能力，帮助细菌在特定环境 下生存和繁殖。
质粒与细菌的进化
基因水平转移
质粒是细菌间基因水平转移的主要载体，有 助于细菌获得新的遗传物质和进化。
协同进化
质粒上的基因与其他细菌基因协同进化，形成复杂 的基因网络，影响细菌的进化方向。
适应性进化
质粒携带的基因可以促进细菌的适应性进化 ，使其更好地适应不断变化的环境。
终止子的作用
终止子是一个特殊的DNA序列，它能够终止复制子的复 制，确保质粒的复制不会无限进行下去。
质粒的复制
复制的起始
复制的调控
质粒的复制起始于复制起始位点，该 位点通常是一个特定的DNA序列，能 够被质粒编码的复制蛋白识别并与之 结合。
质粒载体的概况及构建PPT课件
典型的质粒克隆技术：
① 用限制性内切酶消化DNA样品 ② 用限制性内切酶消化质粒DNA ③ 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 ④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ⑤ 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
质粒（plasmid）
特点： 能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。
（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
质粒载体的概况及制备
质粒载体的概况
1 质粒的定义、命名 2 质粒的基本特性 3 质粒的分类
质粒的定义、命名（：一） 质粒的定义、命名
• 定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
• 命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后 面接实验编号。
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
第三章基因工程载体
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大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
2M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
• 松弛型
▪高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型” 复制控制的质粒(relaxed plasmid)。
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(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•通常拷贝数较高 •克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 •限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶 切点，便于制作酶切图谱。 •外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制 约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。
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(三)带有可供选择的标记
• 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青 霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素 抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一 的限制酶切点。
• 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗 性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株 ，这样较易检查到克隆是否成功。
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
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pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac MCS lacZ’
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章质粒载体PPT课件
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
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6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
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第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
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6
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
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2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
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4、插入失活型的质粒载体
将外源DNA片断插入在会导致选择记号基因 失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛 选，提高获得阳性克隆的几率，这种质粒属 于插入失活型质粒载体。在基因克隆筛选重 组子时非常有用。
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5、正选择的质粒载体
这种质粒载体具有直接选择记号，并可赋予寄主细 胞相应的表型。通过选择具有这种表型特征的转化 子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，提高 选择的敏感性。
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6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
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第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
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大肠杆菌质粒分子的结构示意图
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2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
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4、插入失活型的质粒载体
将外源DNA片断插入在会导致选择记号基因 失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛 选，提高获得阳性克隆的几率，这种质粒属 于插入失活型质粒载体。在基因克隆筛选重 组子时非常有用。
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5、正选择的质粒载体
这种质粒载体具有直接选择记号，并可赋予寄主细 胞相应的表型。通过选择具有这种表型特征的转化 子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，提高 选择的敏感性。
第三章第二节基因工程载体 PPT
3) 氯霉素抗性基因( Cmlr ,Cmr)
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上,阻止蛋白质 合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶,使氯霉素乙酰化,导 致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)与G418抗性(G418r)基因
Kanamycin,Neomycin与G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄 糖苷类抗生素,可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr 等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化,使之不能进入细胞内。
基因工程载体
一、质粒的一般生物学特性
(一)、质粒DNA
1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。
2、质粒DNA分子能够持续稳定地处于染色体外地游离状态,但在一 定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体地复制 而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
3、质粒DNA不仅能在细菌中复制,同时在添加真核复制信号与启动 子后,能够构建出能在原核与真核细胞中均可复制的穿梭质粒,并 在真核细胞中表达,因此这类载体在基因工程中应用广泛。
拷贝数(不用氯霉素扩增,每个细胞含500-700个拷贝)。 (2)、含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα,可利用
-互补原理进行蓝白筛选。 (3)、多克隆位点区(MCS)
由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶 会产生不同的粘性末端,可选用两种内切酶组合在质粒载体与 外源DNA上产生相同的末端,进行双粘端连接,既提高克隆的效 率,又能够定向克隆。
2)指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也能够是选择性的(如TcS),也能够是非选择性的(如TcS, lacZα), 绝大多数为后者。
**有的遗传标记基因能够完成上述两项作用。当充任第一作用时,最好是 选择性标记基因;当完成第二作用时,目前多采纳非选择性的—检测性标记基 因。有的基因是不能用作选择性标记基因(lacZ等)。
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素抗性基因。 3）Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠
杆菌素合成的基因。
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2、根据质粒的传递性 3、根据质粒的拷贝数 4、根据质粒和细菌的关系 5、质粒分布、大小和数目
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二、质粒的基本特性
➢ 寄生性 ➢ 质粒DNA构型 ➢ 质粒DNA编码的表型 ➢ 质粒DNA的复制类型 ➢ 质粒的不亲和性 ➢ 其他特性
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4、影响质粒DNA产量的因素
寄主菌株的遗传背景 质粒的拷贝数及分子大小 寄主菌株的生长条件 培养基的类型等
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1）寄主菌株的遗传背景
使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株， 例如DH5,JM109
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有 功能活性的核酸内切酶I的能力，增进了质粒DNA分子 的稳定性。所以从这类寄主细胞制备的质粒DNA质量 有所改进，产量也得到了提高。
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质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获 得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作 用是分离质粒DNA的关键步骤。
通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。
理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA 顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。
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1、氯化铯密度梯度离心法
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5、质粒的不亲和性
质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同 一寄主细胞系中稳定共存的现象。
质粒彼此之间是互不相容的，这样的质粒属于同一个 不亲和群，如pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。 属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。
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6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
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第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
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8
环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
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9
不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3 种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。
基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括三种共同的 组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。
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3、质粒DNA编码的表型
质粒DNA仅占细胞染色体的1－3％，但却编 码着一些重要的非染色体控制的遗传性状， 包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方 式的因子及其它方面的特征，其中对抗菌素 的抗性时质粒的最重要的编码特性之一。
第三章 质粒载体
第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题
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1
第一节 质粒载体的概况
➢ 质粒的定义、命名、分类、分布 ➢ 质粒的基本生物学特性 ➢ 质粒的分离与纯化
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2
一、质粒的定义、命名、分类、分布
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6
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
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7
2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
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4、质粒DAN的复制类型
严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称 “严紧型”复制控制的质粒。
松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝， 称“松弛型”复制控制的质粒。
质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA 分子的数目。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受 自身的制约，还受寄主的控制。
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优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂；
价格昂贵（氯化铯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）
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2、碱裂解法
原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完 全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补 的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。
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质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
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23
分离纯化质粒DNA的程序
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24
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀； 细胞悬浮液重新悬浮细胞； 裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性； 中和液使线性质粒和染色体DAN复性； 离心除去染色体DAN、蛋白质及RNA等复活物； 含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋 白质； 乙醇沉淀收集质粒DNA。
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号，
分类： 分布：
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3
质粒分类
1、根据质粒的性状特征分为：
1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌
杆菌素合成的基因。
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4
2、根据质粒的传递性 3、根据质粒的拷贝数 4、根据质粒和细菌的关系 5、质粒分布、大小和数目
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5
二、质粒的基本特性
➢ 寄生性 ➢ 质粒DNA构型 ➢ 质粒DNA编码的表型 ➢ 质粒DNA的复制类型 ➢ 质粒的不亲和性 ➢ 其他特性
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4、影响质粒DNA产量的因素
寄主菌株的遗传背景 质粒的拷贝数及分子大小 寄主菌株的生长条件 培养基的类型等
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1）寄主菌株的遗传背景
使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株， 例如DH5,JM109
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有 功能活性的核酸内切酶I的能力，增进了质粒DNA分子 的稳定性。所以从这类寄主细胞制备的质粒DNA质量 有所改进，产量也得到了提高。
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19
质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获 得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作 用是分离质粒DNA的关键步骤。
通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。
理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA 顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。
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1、氯化铯密度梯度离心法
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5、质粒的不亲和性
质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同 一寄主细胞系中稳定共存的现象。
质粒彼此之间是互不相容的，这样的质粒属于同一个 不亲和群，如pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。 属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。
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6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
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18
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
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环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
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不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3 种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。
基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括三种共同的 组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。
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3、质粒DNA编码的表型
质粒DNA仅占细胞染色体的1－3％，但却编 码着一些重要的非染色体控制的遗传性状， 包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方 式的因子及其它方面的特征，其中对抗菌素 的抗性时质粒的最重要的编码特性之一。
第三章 质粒载体
第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题
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第一节 质粒载体的概况
➢ 质粒的定义、命名、分类、分布 ➢ 质粒的基本生物学特性 ➢ 质粒的分离与纯化
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一、质粒的定义、命名、分类、分布
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大肠杆菌质粒分子的结构示意图
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2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
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4、质粒DAN的复制类型
严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称 “严紧型”复制控制的质粒。
松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝， 称“松弛型”复制控制的质粒。
质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA 分子的数目。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受 自身的制约，还受寄主的控制。
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优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂；
价格昂贵（氯化铯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）
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2、碱裂解法
原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完 全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补 的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。
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12
质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
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23
分离纯化质粒DNA的程序
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24
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀； 细胞悬浮液重新悬浮细胞； 裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性； 中和液使线性质粒和染色体DAN复性； 离心除去染色体DAN、蛋白质及RNA等复活物； 含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋 白质； 乙醇沉淀收集质粒DNA。
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号，
分类： 分布：
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质粒分类
1、根据质粒的性状特征分为：
1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌