第三章 凝胶过滤层析..

吸水率和床体积 吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量， 它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝 胶装柱后的体积。 床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。
凝胶颗粒大小
层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通 常以目数（mesh）或者颗粒直径（ μm）来表 示。凝胶颗粒大小决定柱子的分辨率和流速。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
分级分离范围 分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围。 对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以 得到较好的线性分离。 例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋 白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。

随后这一技术得到不断地完善和发展。

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它
具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验
重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。

因此，广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖 等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分 子量的测定、脱盐、样品浓缩等。

原理
1 ) 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而 只能沿着凝胶颗粒间的孔隙向前移动，速度快而首先 流出层析柱，因此流程较短； 2 ) 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔， 可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中， 从一个胶粒孔隙进入另一凝胶颗粒，移动速率慢而最 后流出层析柱；
凝胶粒度与洗脱效果的关系图
3）不同凝胶类型的选择

琼脂糖凝胶、Sephacryl 大分子分离 亲脂分子 LH-葡聚糖凝胶 琼脂糖凝和Sephacryl 规模大，流速快
其他因素如洗脱液的酸碱度
根据各种凝胶的性质选择

4）凝胶用量的计算
二、 凝胶的处理 将所用的干凝胶慢慢倾入5、10倍的蒸馏水中，参照 凝胶说明书溶胀所需的时间进行充分浸泡，并除去 悬浮的小颗粒。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外 ,全部分布于流动相里 ,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Ｋav = 1时,Ve = Vt,意味着该分子完全不 被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部 ,它能均 等地分布在流动相和固定相里 , 在两相分配的比值 为1,而最后流出.
交联度
交联剂占单体和交联体总量的百分数 凝胶颗粒孔径大小与交联度有关
第二节 凝胶介质的分类和性质


1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）

分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子 量物质的凝胶。
2）粒度的选择
目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越 大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢， 适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验， 选用小直径的柱子提高分辨率。


4） 稳定性 对碱比较稳定，在强酸性环境中其糖苷键易水 解 5）吸附性 对碱性蛋白有吸附作用，提高离子强度即可解 决（含NaCl的缓冲液）
②LH-亲脂型葡聚糖
在Sephadex引入羟丙基基团，在有机溶剂中
膨胀，可以分离脂肪酸、甘油脂、类固醇、 维生素、激素类等亲脂性分子的分离。洗 脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等， 也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进 入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。

凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。




商品名Bio－gel 丙烯酰胺与甲叉双丙稀酰胺交联，过硫酸铵为催 化剂，TEMED加速剂。改变交联剂的浓度，可 以改变孔隙，交联剂越多，孔隙越小； 常用型号 P-2和P－300，数字×103为分离的 分子量极限 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本 近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4×105 性质 耐酸，pH1－10稳定，耐受变性剂（尿素、胍 盐等）
1×108 机械强度好，物理 稳定性高于葡聚糖和 聚丙烯酰胺凝胶，但 不耐酸碱（仅在ph4-9 稳定）
琼脂糖凝胶 （Bio－gel） 聚丙烯酰胺凝 胶 （Bio－gel）
A0.5m， A5M… P-2, P-4, P-300…
排阻极限*的10－6, 数字越大，筛孔越大 排阻极限*的10-3 数字越大，筛孔越大
4×105
耐受盐、尿素、胍 盐，pH1－10稳定， 短时超过此范围也可
第三节
凝胶层析基本操作
一、凝胶的选择

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凝胶型号的选择 凝胶粒度的选择 不同凝胶类型的选择 凝胶用量的计算
1）凝胶型号的选择（根据分离的目的）
组别分离，将样品中的大分子物质与小分子物质分开。 脱盐就是一种组别分离。
③ Sephacryl 烯丙烷基葡聚糖和甲叉双丙稀酰胺交联而成。 优点 1）分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108， 远远大于Sephadex的范围。甚至可以分离较大 的病毒颗粒。 2）化学稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很 少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲 等作为洗脱液，耐高温。 3）机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较 耐压，流速可以快些，分辨率也较高。
（3）当0 <Ｋav <1, Vo < Ve< Vt为处于两种极 端行为之间的分子。 （4）Ｋav >1，Ve> Vt,说明凝胶对组分有吸附作 用 , 此时例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超 出理论计算的最大值.

因此分子的正常 Ｋ av 值 0~1 之间 , 这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。


分配系数Ｋav 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（2） 琼脂糖凝胶

商品名 Sepharose（瑞典）
1）琼脂糖与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂 糖，稳定性提高； 2）型号2B,4B，数字代表颗粒中琼脂糖的百分含量， 数字越大，分离的范围越小

Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分离 的分子量极限； 与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝胶 机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些。
第三章
凝胶过滤层析
第一节 第二节 第三节 第四节
凝胶层析的基本原理 凝胶介质的分类和性质 凝胶层析的基本操作 应用
第一节
凝胶层析的基本原理

概念 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析、立体 排阻层析、体积排阻层析，是利用具有立体网 状结构、且呈珠状颗粒的凝胶作为固定相，对 混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技 术。
洗脱液加在柱上的压力 凝胶交联度 凝胶颗粒大小
流速过低
样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗 脱时间长
流速过高
洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差 线性流速控制在2～10cm/h
六、凝胶柱的再生和保存 用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处 理后重新装柱即可再使用。
第四节
应用

脱盐 高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液 中含有的低分子量杂质，可以用凝胶层析 法除去，这一操作称为脱盐。 脱盐时，选择排阻极限小的凝胶适用的凝 胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、 4、6。柱长与直径之比为5-15
葡聚糖凝胶颗粒示意图

1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物 交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同 分子量的样品，称为凝胶过滤。 1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯

乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝
胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般 称为凝胶渗透层析）。
由葡聚糖和环氧氯丙烷交联剂以醚键交联而成 理化性质 1）交联度不同，型号不同，膨胀度和吸水量不同，孔径大 小和分级范围也不同； 2）商业用的型号又G10、G15、G25，G100等，数字代 表每g干凝胶吸水量×10，如G50即表示每克干凝胶的吸水 量为5.0毫升； 3）数字越小，分级范围窄，适合低分子量的蛋白质的分离， 数字越大，适合宽范围分子量的分级
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
（2）样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。
影响流速的因素

分离大分子物质


测定分子量
用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一 条件下层析记录每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对 分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即 分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样 品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗 脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ
计算法： Vt = 1/4 D2h

测量法： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 由于Ｖｇ 非常小，可忽略不计，因此： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ Ｖ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝 色葡聚糖-2000； Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。
琼脂糖凝胶的优点和缺点


优点 琼脂糖凝胶（agarose gel）比葡聚糖凝 胶和生物胶的排阻范围大，可达相对分子质量 108，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和 病毒颗粒；机械性能好。 缺点 不耐酸碱，最好将条件控制在pH 4～9之间， 温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）聚丙烯酰胺凝胶
几种凝胶的比较
种类（商品名） 商品型号 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶 （Sepharose） G15， G25， G100… 2B, 4B, 6B… 型号中数字意义 每g的吸水量(ml)×10 数字越大，筛孔越大 颗粒中琼脂糖的含量 （％）； 数字越大，筛孔越小 排阻限度 6×105 稳定性 水、盐、碱、弱酸 中稳定；对强酸敏感
其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质 完全渗入凝胶内。
分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地 深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最 后得到分离。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。
再用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液在室温下浸 泡0.5h，抽滤除去碱液．用蒸馏水洗至中性。 为了除去凝胶颗粒空隙中的气泡，可把处理过的凝胶 浸泡于蒸馏水或平衡液中用抽气方法实现。
三、 凝胶柱的制备
1）柱的选择 长层析柱分辨效率高于短柱。理想的 直径和长度之比是1：25－1：100 根据经验，组别分离时，大多采用230cm长的层析柱，分级分离时，一般需 要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内。
2）装柱 干装法 容易产生气泡 湿装法 先将适量溶剂加到柱中，将浸泡 好的凝胶缓慢倒入，一直浸泡在溶剂中， 沉降至柱高1/4－1/3时打开下端出口， 溶剂流出。
3）鉴定柱的质量 用带色的物质或蛋白质过柱均匀下降即可。 细胞色素c、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶 液过柱。
四、加样 （1）加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体 积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,