稳定细胞株筛选实验
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。
该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。
启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。
2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。
3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。
选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。
4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。
为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。
常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。
5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。
可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。
总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。
这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。
在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。
但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。
通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。
稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。
通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。
因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
稳定细胞名词解释
稳定细胞名词解释
稳定细胞（stable cells)又称静止细胞（quiescent cell)。
在生理情况下，这类细胞增殖细胞不明显，在细胞增殖周期中处于静止（G0），但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期（G1），表现出较强的再生能力。
稳定细胞株筛选方法
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。
对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。
但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
真核转染稳定筛选标记及原理
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
LOGO
小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
LOGO
外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
耐药细胞株的筛选
耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。
另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。
脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。
将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。
待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。
筛选时间和浓度视细胞而定。
一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。
脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。
慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。
包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。
包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
稳定过表达细胞株的鉴定
稳定过表达细胞株的鉴定
鉴定稳定过表达细胞株是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
通常，稳定过表达细胞株被构建来表达外源基因，这些基因可以编码蛋白质、RNA或其他生物分子。
在构建过程中，细胞株被转染并在筛选过程中选出表达外源基因的细胞株。
然而，仅仅检测外源基因的表达并不足以证明细胞株是稳定的。
为了鉴定稳定过表达细胞株，需要进行以下步骤：
1. 稳定性测试：通过连续培养稳定过表达细胞株多代，观察外源基因表达是否稳定。
通常，细胞株需要在稳定条件下培养至少20代，以确保表达稳定。
2. 比较分析：与野生型细胞株进行比较分析，例如测量细胞增殖速率、形态学、细胞周期等。
如果稳定过表达细胞株与野生型细胞株存在显著差异，则该细胞株可能存在异常。
3. 稳定性标记：将可观察的标记或标签引入到外源基因表达系统中，以确定细胞株是否稳定。
例如，可以将荧光蛋白或其他荧光标记引入到外源基因中，观察标记的表达是否稳定。
通过以上步骤鉴定稳定过表达细胞株，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
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筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418 浓度：1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。
2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。
neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000 个细胞/ml ，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选，选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x10 6个细胞电转后，分别接种1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。
筛选9 天后，观察1/4000 孔内有两三个克隆，按比例1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。
稳定细胞株筛选实验
稳定细胞株筛选实验实验稳定细胞株是指将外源基因通过转染等方式插入到目标细胞中，并通过筛选得到具有稳定表达外源基因的细胞系。
稳定细胞株在研究基因功能、开发生物制药等方面有着广泛的应用。
本实验旨在介绍一种基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法。
实验步骤1. 细胞的培养和分装将需要转染外源基因的细胞经过预处理后分装到96孔板中。
预处理的方法包括细胞数的调整、培养条件的优化等。
2. 转染外源基因将目标外源基因通过转染等方式导入到细胞中。
转染方法包括磷脂质体转染、病毒载体、基因枪等。
转染参数设置需要根据不同类型的细胞和外源基因来优化。
3. 抗生素筛选将不同类型的抗生素添加到分装好的细胞中，各种抗生素对应的筛选浓度需要根据实验的设计来确定。
筛选中心目的是筛选出稳定表达外源基因的细胞株，并筛选出能够在低浓度抗生素下存活的细胞株。
4. 稳定细胞株的测试和验证通过多次传代观察稳定细胞株的稳定性和表达效果，进行各项功能和表达水平的测定，如蛋白表达水平的检测、酶活性检测等，最终得到稳定的细胞株。
实验优化和注意事项1.在细胞分装前需要严格控制细胞数，以避免细胞过密或过稀的情况出现。
2.转染参数的设置需要根据细胞类型和外源基因进行调整，一般需要进行多次实验才能确定最佳的转染条件和过程。
3.实验中选用的抗生素应根据细胞特性和耐药性来确定，合理调整浓度以取得最佳的筛选效果。
4.稳定细胞株的鉴定需要进行多次测试和验证，其中包括蛋白表达水平、酶活性检测等。
实验结果和分析经过实验，我们成功地筛选出了稳定表达外源基因的细胞株。
经过多次传代和验证，细胞株的稳定性和表达效果得到了进一步的确认。
通过此次实验，我们发现抗生素浓度和稳定细胞株的筛选密切相关，合理选择抗生素种类和浓度能够有效地提高细胞株的稳定性和筛选效率。
本实验基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法能够实现稳定表达外源基因的效果，为生物技术、药物开发等领域提供了有力的技术支持。
在实验设计和实验参数设置中需要严格控制，才能取得最好的效果。
嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定细胞株的步骤及方法
嘌呤霉素（Puromycin）筛选稳定细胞株的步骤及方法Puromycin 是来源于Streptomyces alboniger 的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选能够表达pac 基因（puror）的细胞。
pac 基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果该基因表达，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达pac 基因的哺乳动物稳定细胞株。
目前，很多商业化的慢病毒载体都携带pac 基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。
嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac 基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
Puromycin 不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。
Puromycin 的作用特点是快速作用于细胞，一般2 天内可以杀死99%的不表达pac 基因的细胞。
本产品浓度为10mg/ml，已过滤除菌，可以直接用于细胞培养。
使用说明：一、推荐工作浓度：推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml，但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。
二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定( 以shRNA ）转染或者慢病毒感染为例）：：嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。
为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株，确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。
对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。
1、第一天：24 孔板中以5~8×10 4 cells/孔的密度接种细胞，接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。
细胞培养箱内培养过夜。
2、第二天：在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml 等)，更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项一、实验步骤1. 实验前准备：实验前要穿戴好防护服、手套、口罩等防护用品，确保实验室安全。
2. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动冻存管，使其迅速融化。
然后打开冻存管，将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入适量培养基，吹匀后离心。
3. 细胞计数：将离心后的细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下观察并计数。
4. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 药物处理：根据实验需要，向培养皿中加入不同浓度的药物，观察细胞的生长情况。
6. 细胞收获：当细胞生长到一定数量时，用胰酶消化并收集细胞。
7. 基因检测：将收集的细胞进行基因检测，验证稳转细胞系的筛选是否成功。
8. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出结论。
二、注意事项1. 实验操作过程中要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
2. 在处理细胞时要轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
3. 在加入药物时要准确控制浓度和作用时间，避免对细胞造成毒性作用。
4. 在进行基因检测时要确保引物和探针的特异性，避免假阳性或假阴性结果。
5. 在数据分析时要考虑到实验的重复性和可重复性，避免误差和偏差。
6. 在实验过程中要保持实验室的清洁卫生，及时清理废弃物和垃圾。
7. 在实验结束后要及时记录实验数据和结果，并进行总结和归纳。
8. 在进行稳转细胞系筛选时要注意选择合适的筛选标记物，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
9. 在进行基因检测时要注意选择合适的检测方法和技术，以确保检测结果的准确性和可靠性。
10. 在进行稳转细胞系筛选时要注意控制细胞的生长条件和环境因素，以确保细胞的生长和表型特征的稳定性。
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选是一种利用染色体工程技术实现长期稳定地保存和表达特定基因的方法。
稳转株的建立具有重要的科学价值，可以大大提升研究的效率，进而加快新药的研发速度。
稳转株的建立主要包括三个步骤：1.基因构建；2.转染载体构建；3. 稳转株建立。
1.基因构建是将转染基因构建成转染载体所需要的形式。
一般来说，需要经过PCR扩增、DNA合成、引物设计等步骤，最终得到最终的基因构建。
2.转染载体构建是将基因与转染载体结合起来，使基因能够被转染载体携带，并且可以被细胞内表达。
一般来说，转染载体构建需要进行DNA合成、PCR扩增、克隆、测序验证等步骤。
3.稳转株建立是将转染载体转染到目标细胞中，并获得稳定表达特定基因的稳转株。
一般来说，稳转株建立包括转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤。
转染载体转染是将转染载体转染到细胞内的过程，可以通过质粒转染、质粒融合、质粒导入、病毒感染等方法来实现。
筛选是将转染后的细胞分为稳定表达和不稳定表达两类，以获得稳定表达特定基因的细胞株，常用的筛选方法有抗性筛选、荧光筛选等。
稳定性验证是在筛选后，通过RT-PCR、Western blot、荧光免疫等方法，来证明稳转株能够稳定表达特定基因。
建立稳转株后，还需要进行稳定性监测，以确保稳转株能够稳定表达特定基因。
除了上述方法，也可以采用其他方法如遗传筛选、生物信息学分析等来进行稳定性监测。
总之，稳转株的建立与筛选是一个复杂的过程，需要经过基因构建、转染载体构建、转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤，最终获得稳定表达特定基因的稳转株。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
单克隆细胞株筛选实验心得
单克隆细胞株筛选实验心得
单克隆细胞株筛选实验是一项技术要求高、步骤繁琐的实验，
需要严谨的操作和耐心的观察。
以下是我进行单克隆细胞株筛选实
验的一些心得体会：
1.实验前要充分了解实验原理和步骤，熟悉各种试剂和仪器的
使用方法。
只有掌握了基本原理和操作技巧，才能更好地进行实验。
2.实验前要做好充分的准备工作，包括试剂的配制、仪器的校
准和细胞的传代等。
这些看似简单的步骤，却是实验成功的关键。
3.在进行单克隆细胞株筛选实验时，要保证实验条件的恒定，
避免污染和交叉污染。
同时，要保证细胞的生长状态良好，避免细
胞的变异和死亡。
4.在进行细胞筛选时，要选择合适的筛选方法，如有限稀释法、流式细胞术等。
这些方法的选择要根据具体情况而定，需要综合考
虑细胞的特性和实验的目的。
5.在实验过程中，要仔细观察细胞的生长状态和形态特征，及
时发现异常情况并进行处理。
同时，要做好实验记录，包括细胞生
长曲线、试剂使用情况等，以便后续的数据分析和总结。
6.实验结束后，要及时清洗仪器和整理实验室，保持实验室的
整洁和卫生。
同时，要做好数据的整理和分析工作，总结实验结果
并撰写实验报告。
总之，单克隆细胞株筛选实验需要严谨的操作和耐心的观察。
只有掌握了基本原理和操作技巧，才能更好地进行实验。
同时，要
注意实验安全和环境保护，避免意外事故的发生。
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(完整word版)稳定细胞株筛选实验
稳定细胞株筛选实验本实验使用过表达human Oct-4—EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。
该病毒的表达框为pLenti—CMV-Oct—4-EGFP-3FLAG—PGK—Puro： CMV启动子驱动Oct-4—EGFP基因的表达，同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。
在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。
从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。
关键词:Oct—4—EGFP,稳定细胞株，HeLa，慢病毒一、实验原理外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达）.前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。
后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。
建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。
最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素(puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选.传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株, 该方法阳性率低，周期长，工作量大。
慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。
利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。
筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白,用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
[晶莱生物]二、实验目的通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。
稳转细胞系构建-ZXD
稳转细胞构建
构建载体（过表达/干扰） 慢病毒包装
细胞复苏、传代 嘌呤霉素浓度筛选
慢病毒感染 筛选抗性细胞 鉴定及扩大培养
稳转细胞系建
1、载体构建及慢病毒包装（略） 2、细胞复苏及传代 3、确定嘌呤霉素最优筛选浓度：
1）培养待转染（而不是转染后）的细胞。 2）取对数生长期的细胞，用培养基制成细胞密度为1.5×105 个/ml的细胞悬液。 3）96孔培养板每孔加入100ul细胞悬液（使每孔细胞数在1.5×104个），37℃培养箱中培养 过夜。 4）分别加入不同浓度嘌呤霉素，使终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml，每日检查细 胞活力，筛选出最佳浓度。
Thanks！
稳转细胞系筛选实验
简介
稳定转染就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期 表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高 转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进 行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。 筛选稳定细胞系有两种方法： 1）转染质粒后，筛选获得稳转细胞系； 2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法 更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。 应用： 1）基因过表达服务 2）shRNA 干扰服务 3）miRNA过表达 4）任意非编码基因的过表达
简介
为什么要挑选单克隆细胞 多克隆细胞株筛选比较快速，费用较低。 单克隆细胞株筛选周期长，费用高。 多克隆细胞系构建成功后由于不同细胞克隆生长速度不一致，目的基因表达 量比较低的细胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右会观察到表 达量逐渐下降，最后高表达量低增殖速度的细胞消失，低到中等表达量的细 胞组成稳定表达克隆。 对于转染效率和表达效率低的细胞系，多克隆细胞筛选得到的细胞系中目的 基因的表达量有可能不能满足实验要求。 单克隆细胞系在细胞克隆挑选后可以对目的基因表达量进行检测，挑选出高 表达的细胞克隆进行培养。这一步骤在转染效率低的细胞株中尤其重要。 做细胞亚定位的稳定细胞系，存在表达量过低、荧光信号不够强，以及表达 量过高、荧光蛋白聚集导致不能正确定位两种问题。单克隆细胞系挑选可以 直接选出定位正确的细胞克隆。
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稳定细胞株筛选实验
本实验使用过表达human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。
该病毒的表达框为pLenti-CMV-Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV启动子驱动Oct-4-EGFP基因的表达，同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。
在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。
从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。
关键词：Oct-4-EGFP，稳定细胞株，HeLa，慢病毒
一、实验原理
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。
后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。
建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。
最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。
传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株，该方法阳性率低，周期长，工作量大。
慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。
利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。
筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
[晶莱生物]
二、实验目的
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。
三、实验步骤
实验共分以下3个主要步骤：
1.细胞铺板
将HeLa细胞按30%的融合度接种到24孔板：
1)HeLa细胞配成1×105 cells/mL细胞悬液，待铺板。
2)每孔铺500μL，即5×104 cells/well，铺1块24孔板。
2.感染慢病毒
12~20h后感染慢病毒：
1)根据公式计算病毒用量：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。
2)本实验中MOI取10，吸去与加入病毒体积相同培养基。
3)每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene终浓度达到5μg/mL。
4)24h后换，弃去培养基后每孔加入500μL新鲜的培养基。
3.稳定株筛选
1)72h以后，加入终浓度2μg/μL puromycin。
每隔2-3天换一次终浓度2μg/μL puromycin 新鲜培养基。
2)药物筛选约10天后，拍荧光照片。
3)稳定细胞株冻
结论：从图1可以看到，在MOI为10条件下，HeLa的感染效率约为80%。
根据图2，使用puromycin药物筛选10天后，表达目的基因的HeLa的比例在90%以上，且荧光亮度增强。
Oct-4-EGFP稳定表达的HeLa细胞株筛选成功。