chip基本实验步骤
chip原理及实验步骤
chip原理及实验步骤芯片（chip）是电子技术中常用的一个概念，它是指集成电路的一种封装形式。
芯片原理就是将多个电子器件、电路和元件集成到一块硅片上，并通过微影技术将电路图案化，最终形成一个完整的电子系统。
下面将介绍芯片的原理及实验步骤。
一、芯片原理芯片的原理主要包括以下几个方面：1.1、集成电路技术：芯片采用集成电路技术，将多个电子器件和电路集成到一块硅片上，通过微影技术将电路图案化，形成一个完整的电子系统。
1.2、微电子工艺：芯片的制造过程中采用微电子工艺，包括光刻、蒸镀、离子注入、扩散等步骤，通过这些工艺将电路图案化并形成电子器件。
1.3、材料选择：芯片的制造需要选择合适的材料，如硅片、金属、绝缘材料等，这些材料的性能和特点会直接影响芯片的性能和稳定性。
1.4、电路设计：芯片的设计是芯片原理的关键，通过合理的电路设计可以实现不同的功能和应用，如处理器芯片、存储芯片、传感器芯片等。
二、芯片实验步骤芯片的实验步骤主要包括芯片制造、芯片测试和芯片封装等过程。
2.1、芯片制造芯片的制造是芯片实验的第一步，主要包括以下几个步骤：（1）芯片设计：根据实验需求和功能要求，进行芯片电路设计，确定芯片的布局和电路结构。
（2）芯片加工：根据电路设计，采用微电子工艺将电路图案化，形成电子器件，包括光刻、蒸镀、离子注入等制造步骤。
（3）芯片测试：对制造好的芯片进行测试，检测芯片的性能和功能是否符合设计要求。
2.2、芯片测试芯片测试是为了验证芯片的性能和功能是否符合设计要求，主要包括以下几个步骤：（1）功能测试：对芯片进行功能测试，验证芯片是否能够正常工作和完成设计的功能。
（2）性能测试：对芯片进行性能测试，包括速度、功耗、温度等方面的测试，验证芯片的性能是否满足要求。
（3）可靠性测试：对芯片进行可靠性测试，包括老化测试、温度循环测试等，验证芯片的可靠性和稳定性。
2.3、芯片封装芯片封装是将制造好的芯片封装到外部封装材料中，以保护芯片并方便连接外部电路。
chip 操作步骤
磁珠吸附法chip操作步骤及试剂配方1、每盘细胞（8ml培液），加入11×Fixation solution 800ul使得甲醛的终浓度为1%，fixation solution为现配，室温摇床10min。
(甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。
甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析; 交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。
交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。
甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
)2、终止交联：加1M甘氨酸1.26ml，使其终浓度为0.125。
室温摇床5min。
3、用冰冷的PBS 冲洗两次后，加适量pbs+pmsf，用细胞刷刮下细胞，4℃ 1000RPM离心5min。
4、倒去上清，加入1ml Scell Lysis Buffer，冰上放置10min，匀浆器匀浆后转入2ml Ep管中，4℃ 5000RPM离心5min.5、弃上清，300ul nuclei Lysis buffer，吹散沉淀。
6、socinate破碎：1min on off 30 10次左右，4℃ 13000RPM离心20min，琼脂糖胶电泳，亮带集中在1000bp左右的方可。
(以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。
)7、分别收集20ul样品做input -20℃保存。
(Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
)8、用 Chip Diluiton Buffer 稀释样品10倍9、准备beads，用Pre-Blocking buffer for dynabeads 洗beads3次.(Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合)，最好实验前一天准备beads。
(完整版)ChIP实验步骤
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200 ul含2×106个细胞。
这样每100ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共8 00ul。
7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。
共14次（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。
去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于-80oC。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4 ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×P IC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。
4oC颠转混匀1h。
10、1h后，在4摄氏度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。
各留取20ul做为input。
一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。
ChIP实验流程整理
1、ChIP实验用的苗是正常光照条件下生长的四周大的苗子，取1.5克嫩苗组织，放入50ml 1%甲醛溶液中，抽真空交联。
2、用2.5ml 2M甘氨酸溶液停止交联反应。
3、水洗苗子数次，然后将苗用吸水纸吸干，液氮碾磨，然后用25ml提取缓冲液1重悬。
extraction buffer I0.4 M sucrose,10 mM Tris-HCl, pH 8,10 mM MgCl2,5mM b-mercaptoethanol,0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF],1* protease inhibitor; Roche),4、用神奇滤器或者是金属筛过滤，然后4000rpm, 4℃离心20分钟5、用1ml提取缓冲液2，重悬沉淀物，14,000 rpm ，4℃离心10分钟。
extraction buffer II0.25 M sucrose,10 mM Tris-HCl, pH 8,10mMMgCl2,1%Triton X-100,5mM b-mercaptoethanol,0.1mM PMSF,1*protease inhibitor)6、用300ul提取缓冲液3，重悬沉淀物，14,000 rpm ，4℃离心60分钟。
extraction bufferIII1.7Msucrose,10mMTris-HCl, pH8,0.15%Triton X-100,2mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol,0.1mM PMSF,1*protease inhibitor)7、粗核提取物用200ul裂解缓冲液重悬，在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。
8、超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。
超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。
超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
(完整word版)ChIP实验流程整理
1、ChIP实验用的苗是正常光照条件下生长的四周大的苗子，取1.5克嫩苗组织,放入50ml 1％甲醛溶液中,抽真空交联。
2、用2。
5ml 2M甘氨酸溶液停止交联反应。
3、水洗苗子数次，然后将苗用吸水纸吸干，液氮碾磨，然后用25ml提取缓冲液1重悬.extraction buffer I0。
4 M sucrose,10 mM Tris-HCl， pH 8，10 mM MgCl2,5mM b-mercaptoethanol，0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF］,1＊ protease inhibitor； Roche)，4、用神奇滤器或者是金属筛过滤，然后4000rpm， 4℃离心20分钟5、用1ml提取缓冲液2,重悬沉淀物,14，000 rpm ,4℃离心10分钟。
extraction buffer II0.25 M sucrose,10 mM Tris—HCl， pH 8,10mMMgCl2，1％Triton X-100，5mM b—mercaptoethanol,0。
1mM PMSF,1＊protease inhibitor)6、用300ul提取缓冲液3,重悬沉淀物,14，000 rpm ，4℃离心60分钟.extraction bufferIII1。
7Msucrose,10mMTris-HCl， pH8,0.15%Triton X—100，2mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol，0.1mM PMSF,1＊protease inhibitor)7、粗核提取物用200ul裂解缓冲液重悬,在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞.8、超声处理，以剪切基因组DNA,使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp 则更佳。
超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。
超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
ChIP原理及实验方法
ChIP原理及实验方法ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要用于探究转录因子与染色质的相互作用、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。
下面将详细介绍ChIP的原理和实验步骤。
ChIP的原理：ChIP的基本原理是通过特异性抗体结合到目标蛋白质上，然后通过交联、裂解、免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段。
通过对这些DNA片段的分析，可以了解目标蛋白质在染色质上的分布情况，从而揭示蛋白质与DNA相互作用的生物学功能。
ChIP的实验步骤：1.交联：将细胞或组织与甲醛交联，使蛋白质与DNA形成稳定的结合。
2.裂解：将交联的样品进行裂解，使细胞核和染色质释放出来。
3.免疫沉淀：将特异性抗体加入裂解的样品中，使其与目标蛋白质结合。
通过免疫沉淀，可以分离出与抗体结合的蛋白质-DNA复合物。
4.洗涤：通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质和DNA。
5.解交联：通过高温或酶解去除交联，使DNA恢复原始状态。
6.DNA提取：将解交联后的样品进行DNA提取，获取与目标蛋白质结合的DNA片段。
7.PCR扩增：使用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR扩增，以检测目标DNA片段的存在与否。
8.数据分析：通过测定PCR产物的数量，可以推断目标蛋白质在染色质上的结合情况。
ChIP的注意事项：1.选择合适的抗体：要确保选择的抗体具有高特异性和敏感性，以避免误差和背景信号。
2.优化实验条件：包括交联时间、裂解方法、洗涤条件等，以获得清晰的信号和较低的背景噪音。
3.正负对照组：需要设置正负对照组，以验证实验结果的可靠性。
4.数据分析：可以使用定量PCR、测序等方法对ChIP的结果进行定量和定性分析。
总结：ChIP是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的重要实验方法。
通过ChIP，可以了解转录因子在染色质上的定位、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。
CHIP实验操作
ChIP实验操作指南国家瓜果改良中心荔枝分中心采用Bowler等（2005）的方法，具体如下：1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。
2加40 ml超纯水于离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2次。
3去掉尽可能多的水，再加入37ml 1% 甲醛，与15-25 ℃，真空放置15 min。
4 加入2.5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M，再真空放置5 min。
5 加40ml超纯水与离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。
6去掉尽可能多的水，液氮速冻后-80℃保存或直接利用。
第一天1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3，并4 ℃预冷。
2 液氮淹没样品，样品尽量磨碎，注意不用潮解样品。
3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ，再将样品粉末加入离心管中，轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min.4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷，用两层滤膜将样品过滤入该离心管，如果滤液中仍有残渣，重复步骤4。
5 4 ℃， 3000g 离心10min。
6 小心弃上清，加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀，移入进口（或严格灭菌）的1.5ml 离心管，4 ℃，12000g离心溶液10Min.7 小心弃上清，加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀，但要避免起泡。
（核酸提取液3很粘稠，但还是要尽量重悬浮好沉淀）。
8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3，再将步骤7的溶液小心加入上层，4 ℃，16000g离心溶液1h（准备步骤9，制一块1%琼脂糖凝胶，用80μl CHIP 洗液洗磁珠）。
9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。
10 小心弃上清，加入300μl预冷核酸裂解液，于冰上用（剪过尖端）枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀，但要注意避免起泡。
并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。
chip基本实验步骤
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将proteinA/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。
我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。
a. 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。
然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl 的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。
CHIP实验步骤
CHIP实验步骤CHIP（Chemiluminescence Immunoassay Platform）是一种化学发光免疫分析平台，用于检测生物样本中的目标分子。
以下是进行CHIP实验的一般步骤，包括准备试剂和设备、样本处理、操作步骤、结果分析等。
1.准备试剂和设备a.试剂：准备所需的试剂，包括化学发光底物、缓冲液、酶标抗体、标准物质等。
b.CHIP分析仪：确保设备完好，对仪器进行校准和灵敏度测试。
2.样本处理a.生物样本采集：根据研究目的选择适当的生物样本，如血清、尿液或细胞培养上清等。
b.样本预处理：根据实验要求，进行样本的预处理，如离心、冻存等。
c.样本稀释：对样本进行适当的稀释，以保证在检测范围内。
3.实验操作a.准备酶标板：将酶标板板孔均匀涂覆酶标抗体，或者根据实验需要的反应物质进行固定。
b.加入标准曲线：将标准物质以不同浓度加入酶标板孔中，用于绘制标准曲线。
c.加入样本：将处理好的样本加入空白酶标板孔中，并与标准曲线孔一同进行测定。
d.加入辅助试剂：加入辅助试剂，如酶标抗体、荧光素底物等，使其与样本中的目标分子反应。
e.反应：将酶标板放入恒温水浴或实验室平台，使其反应一定时间。
f.清洗：将酶标板反复洗涤，去除未与目标分子结合的物质。
g.加入底物：加入化学发光底物，使其与酶标板上的酶反应发光。
h.测量发光：将酶标板装入CHIP分析仪中，测量发光强度。
4.数据分析a.标准曲线测定：根据标准曲线上各点的发光强度，绘制标准曲线，用于计算未知样本中目标分子的浓度。
b.样本浓度计算：根据未知样本的发光强度，通过标准曲线插值法计算目标分子的浓度。
c.质控分析：检查质控样本的测定结果是否在预设范围内，以确保实验的准确性和可靠性。
d.统计分析：对实验结果进行统计分析，如平均值、标准差等。
通过实验步骤的规范操作，可以使用CHIP分析平台进行免疫分析，检测生物样本中的目标分子。
这种分析方法具有灵敏度高、快速、准确性以及对多个样本的同时处理能力等优点，被广泛应用于临床诊断、药物研发、食品安全等领域。
CHIP实验操作过程
CHIP实验操作过程（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），在9ml培养基中加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
2、37摄氏度孵育10min。
（此时准备1*PBS，加入蛋白酶抑制剂混合物5ul/ml）。
3、终止交联：加10*甘氨酸900ul，混匀后，在室温下放置5min即可，置冰上。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、加入含有蛋白酶抑制剂的PBS 2ml，细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。
预冷后4度，700g，5min收集细胞。
（此时准备SDS Lysis buffer，加入蛋白酶抑制剂混合物5ul/ml）。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80％。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer，将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙（共18S*3+9S）。
共14次。
（破碎前可取10ul样品，用于琼脂糖电泳，冻存）（二）、除杂及抗体孵育。
8、超声破碎结束后，15.000g 4度离心10min，去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于－80度，最多可以保存2个月。
（可取10ul样品，用于琼脂糖电泳，冻存）300ul中，100ul加抗体（anti-STAT1）做为实验组；100ul加anti-RNA Polymerase II做为阳性对照组；100ul加Normal rabbit IgG作为阴性对照。
9、15ml离心管，300ul的超声破碎产物中，加入2.7ml ChIP Dilution Buffer和13.5ul的Protease Inhibitor Cocktail II，再加入180ul Protein G Agarose，4度颠转混匀1h。
CHIP实验步骤
CHIP-qPCR实验步骤一、实验材料●主要试剂●主要仪器及器材二、实验步骤1. 细胞交联：a. 用1ml PBS重悬细胞；b.加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；c.加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；d.4℃，3000g，离心3min；弃上清液；e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。
f．重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；2. 胞核制备和染色质碎裂：a. 用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；b. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；c. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴30min，期间5min混匀一次；e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；g. 用100μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；h. 冰上超声打断5次，每次2min。
i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中3. 免疫沉淀：a. 取10ul上清作为input,-20℃冻存备用；b. 取90ul上清加入410ul X IP Dilution Buffer；阳性对照组加入10ul Anti-RNA Polymerase II Antibody，IP组加入10ug目的抗体；阴性对照组加入2μL IgG 。
c. 样本管放到翻转仪4℃翻转过夜孵育；d. 震荡混匀Protein A/G磁珠，并取20ul到每个实验组中；e. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；g．将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；h. 重复步骤f~g 3次；i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；j. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；4. 洗脱：a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，37℃震荡孵育30min；b.将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；d.各样本中分别加入6μL NaCl(5M) 、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);e. 65℃孵育2h;f. 使用DNA 纯化离心柱从样品中纯化DNA。
ChIP实验步骤
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200 ul含2×106个细胞。
这样每100ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共8 00ul。
7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。
共14次（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。
去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于-80oC。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4 ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×P IC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。
4oC颠转混匀1h。
10、1h后，在4摄氏度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。
各留取20ul做为input。
一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。
ChIP具体操作流程
ChIP具体操作流程ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究染色质蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
下面是ChIP的具体操作流程：1.细胞或组织处理：a.培养或收集要研究的细胞或组织。
b.如有需要，对细胞或组织进行处理，如刺激、药物处理等。
2.交联：a.向培养细胞或组织中加入足量的交联剂，如甲醛，使染色质与蛋白质交联。
b.在室温下轻轻摇动培养细胞或组织，使交联剂充分混合。
3.停止交联：a.加入甘氨酸或甘氨酸盐酸盐来中和剩余的交联剂。
b.在室温下继续摇动培养细胞或组织。
4.细胞或组织裂解：a.用裂解缓冲液裂解交联细胞或组织，释放出染色质。
b.在冰上孵育细胞或组织，使细胞或组织裂解。
5.染色质切割：a.使用限制性内切酶或超声波将染色质切割成较小的片段。
b.在室温下孵育样品，使切割反应进行。
6.免疫沉淀：a.加入特异性抗体（抗目标蛋白）到裂解的细胞或组织中，与目标蛋白结合。
b.在4℃下孵育样品，使抗体与目标蛋白结合。
c.加入蛋白A/G琼脂糖磁珠，使其与抗体-蛋白质复合物结合。
d.在4℃下孵育样品，使磁珠与抗体-蛋白质复合物结合。
7.洗涤：a.使用洗涤缓冲液洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白质和DNA。
b.重复洗涤步骤，至少洗涤3次。
8.去交联：a.加入适量的去交联缓冲液，去除染色质与蛋白质的交联。
b.在65℃下孵育样品，使染色质与蛋白质解交联。
9.DNA纯化：a.使用DNA提取试剂盒提取免疫沉淀后的DNA。
b.按照提取试剂盒的操作手册进行操作。
10.DNA定量和质检：a.使用紫外可见光谱仪或荧光光度计测量提取的DNA的浓度。
b.使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的大小和纯度。
11.DNA分析：a.使用PCR、实时荧光PCR、测序等方法对ChIP后的DNA进行分析。
b.根据需要选择适当的方法进行进一步的分析。
需要注意的是，不同实验室可能会有一些微小的差异或优化步骤，这些步骤可能根据具体实验要求而有所不同。
此外，ChIP实验是一个复杂的过程，需要仔细操作和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
ChIP基本流程图
ChIP基本流程图ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究蛋白质与染色质相互作用的实验技术。
下面是ChIP的基本流程图，以便更好地了解该技术的原理和步骤。
1.交联：首先，将细胞或组织交联。
这一步骤的目的是固定蛋白质-DNA复合物，以便后续的实验处理。
交联通常通过添加交联剂（如甲醛）来完成。
2.细胞裂解：将交联的细胞或组织裂解，以释放细胞核。
这可以通过机械破碎、化学裂解或超声波处理来完成。
裂解的目的是将染色质解离为小片段，以便后续的免疫沉淀步骤。
3.DNA切割：使用特定的限制酶或酶切剂切割DNA。
这一步骤的目的是产生适当大小的DNA片段，以便后续的免疫沉淀和测序分析。
4.免疫沉淀：将特定抗体与要研究的蛋白质结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白质的单克隆或多克隆抗体。
将抗体与它们所结合的蛋白质-DNA复合物一起孵育，以形成抗原-抗体复合物。
5.洗涤：使用缓冲液洗涤掉非特异性的蛋白质-DNA复合物，以去除非特异性结合的物质。
这一步骤的目的是减少背景噪音，提高实验的特异性。
6.反交联：通过加热或酶切等方法去除交联剂，以使蛋白质-DNA复合物解离。
这将使DNA片段从蛋白质中释放出来，以便后续的纯化和分析。
7.DNA纯化：纯化被免疫沉淀的DNA片段，以去除杂质。
这可以通过酚/氯仿提取、柱层析或磁珠纯化等方法完成。
8.DNA分析：对纯化的DNA片段进行进一步的分析。
这可以包括PCR扩增、测序、芯片分析或基因组定位等技术。
这些分析将帮助确定与特定蛋白质结合的DNA区域，并揭示蛋白质与基因调控之间的关系。
ChIP作为一种重要的基因组学技术，广泛应用于研究基因调控、表观遗传学和疾病发生机制等方面。
通过了解ChIP的基本流程，我们可以更好地理解该技术的原理和操作步骤，从而更好地利用它来解答科学问题。
ChIP技术的实验原理和应用
ChIP技术的实验原理和应用概述ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) 技术是一种用于研究染色质上蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用的方法。
其原理是利用特异性抗体来富集与目标蛋白质相互作用的染色质区域，通过分析富集后的DNA序列，可以确定目标蛋白质的结合位点以及与之相关的基因表达调控网络。
ChIP技术已被广泛应用于研究基因表达调控、染色质重塑、疾病发生机制等领域。
实验原理ChIP技术的实验流程主要包括以下几个步骤：1.交联：将细胞或组织交联，固定染色质蛋白质与DNA的结合状态，一般使用甲醛进行交联。
2.细胞裂解：将交联的细胞裂解，释放出染色质蛋白质-DNA复合物。
裂解可以采用物理方法（如超声波破碎）或化学方法（如胶体法）。
3.DNA片段化：使用限制性内切酶或酶切剂，将染色质蛋白质-DNA复合物切割成小片段。
切割后的DNA片段长度与目标蛋白质的结合区域有关。
4.免疫沉淀：将特异性抗体加入到裂解液中，与目标蛋白质结合，并形成抗体-目标蛋白质-DNA复合物。
通过抗体的亲和力可以选择性地富集目标蛋白质结合的DNA片段。
5.洗涤：将非特异性的DNA片段和其他不相关的蛋白质从免疫沉淀物中洗脱。
洗涤的条件要求严格，以确保只保留目标蛋白质与DNA结合的片段。
6.反交联：通过加热或酶解的方法解除交联，使得DNA片段恢复到自由状态。
7.DNA纯化：对反交联后的DNA片段进行纯化和提取，以得到富集的DNA样品。
实验应用ChIP技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
下面列举了ChIP技术在不同领域的应用：1.基因表达调控研究：ChIP技术可以用于研究转录因子与DNA结合的位点，从而揭示基因表达的调控网络。
通过ChIP-seq技术可以高通量地测定全基因组范围内的转录因子结合位点，并进一步分析与这些结合位点相关的基因表达调控元件。
2.染色质结构与重塑研究：ChIP技术可以用于研究染色质的结构和重塑。
chip实验原理及步骤 组织
chip实验原理及步骤组织一、实验原理芯片实验是指利用芯片技术进行实验研究的一种方法。
芯片是一种集成电路，通过在其上布置电子元件和电路连接，实现特定功能。
芯片实验的原理是通过设计和制作芯片，然后进行测试和分析，以验证芯片的性能和功能。
二、实验步骤1. 芯片设计：首先，根据实验目的和要求，进行芯片的设计。
设计包括确定芯片的功能、电路结构和电路元件的布局等。
设计过程中需要考虑电路的可靠性、功耗、布线长度等因素，以保证芯片的性能和稳定性。
2. 芯片制作：在芯片设计完成后，需要进行芯片的制作。
制作过程包括光刻、薄膜沉积、腐蚀、清洗等步骤。
光刻是将设计好的电路图案转移到硅片上的过程，薄膜沉积则是在硅片表面沉积一层薄膜，用于保护电路结构。
腐蚀是通过化学腐蚀的方法，将不需要的薄膜去除。
最后，对芯片进行清洗，去除表面的杂质，以保证芯片的质量。
3. 芯片测试：制作完成的芯片需要进行测试，以验证其性能和功能是否符合设计要求。
测试包括功能测试、性能测试和可靠性测试等。
功能测试是通过输入特定的信号，观察输出是否符合预期，以验证芯片的功能是否正常。
性能测试是测试芯片在不同工作条件下的性能指标，如速度、功耗等。
可靠性测试是对芯片进行长时间的工作测试，以评估芯片的可靠性和稳定性。
4. 数据分析：在芯片测试完成后，需要对测试结果进行分析。
分析包括对测试数据的统计、对比和评估等。
通过数据分析，可以得出芯片的性能指标、优缺点等信息，为后续的优化和改进提供参考。
5. 优化和改进：根据对芯片测试结果的分析，可以对芯片进行优化和改进。
优化和改进包括调整电路结构、优化布线、改进电路元件等。
通过优化和改进，可以提高芯片的性能和功能，进一步满足实验的需求。
6. 结果总结：最后，根据实验的目的和要求，对芯片实验的结果进行总结。
总结包括对芯片的性能、功能、优缺点等方面的评价，并提出对后续工作的建议和展望。
三、实验注意事项1. 在芯片设计过程中，需要考虑电路的可靠性和稳定性，避免出现电路故障或不稳定的情况。
CHIP实验流程图
CHIP实验流程图1.实验准备1.1准备实验所需的器材和试剂：包括CHIP试剂盒、离心管、PCR管、电泳仪等。
1.2清洗实验器材：使用去离子水和酒精对实验器材进行清洗和消毒。
1.3准备实验样本：从细胞培养物或组织中提取DNA，并进行纯化和浓缩。
1.4质检实验样本：使用比色法或紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。
1.5设计实验方案：根据实验目的和样本特点，设计合适的实验方案。
2.交叉连接试验2.1设计引物：根据需要扩增的目标序列，设计合适的引物。
2.2 制备PCR反应体系：将引物、模板DNA、Taq酶和其他试剂按照一定比例加入PCR管中。
2.3进行PCR扩增反应：使用PCR仪对PCR反应体系进行温度循环扩增。
2.4检测PCR产物：将PCR产物进行电泳分析，观察扩增结果。
2.5确认PCR产物：使用测序技术对PCR产物进行测序，确认扩增结果。
3.CHIP实验3.1 交叉连接反应：将DNA样本与蛋白质进行交叉连接反应，形成DNA-protein结合物。
3.2 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液将细胞裂解，释放DNA-protein结合物。
3.3 DNA纯化：使用离心管将DNA-protein结合物离心，将上清液中的DNA进行纯化。
3.4DNA修饰：将纯化后的DNA进行修饰，如去磷酸化或甲基化等。
3.5 免疫沉淀：使用特异性抗体对DNA-protein结合物进行免疫沉淀。
3.6洗涤和离心：对免疫沉淀产物进行洗涤和离心，去除非特异性结合物。
3.7 DNA解交联：对免疫沉淀产物进行加热处理，解除DNA-protein结合。
3.8DNA纯化：使用离心管将解交联产物离心，将上清液中的DNA进行纯化。
3.9 DNA测序：对纯化后的DNA进行测序，获取DNA-protein结合物的序列信息。
4.结果分析4.1数据处理：将测序数据进行质量控制和去除低质量序列。
4.2 数据比对：将测序数据与参考基因组进行比对，找到DNA-protein结合位点。
CHIP技术操作步骤
CHIP技术操作步骤CHIP（Chemical Identification Profile）技术是一种常用于药物研发、化学分析和化学生物学研究的分析技术。
它基于微流控技术，可以实现高通量的化学反应和分析。
以下是CHIP技术的操作步骤：1.设计和制造CHIP芯片：首先，根据实验需求设计和制造CHIP芯片。
CHIP芯片通常由透明的玻璃或聚合物材料制成，其表面经过特殊处理，可以固定化分析物质，如抗体、酶、核酸等。
2.洗涤和预处理CHIP芯片：在使用之前，需要对CHIP芯片进行洗涤和预处理，以去除可能存在的污染物，并使芯片表面更适合固定化分析物质。
3.固定化分析物质：将需要固定化的分析物质溶液加到CHIP芯片的特定区域，利用化学键或物理吸附的方法将分析物质固定在芯片表面上。
这个过程通常需要在适当的pH、温度和时间条件下进行。
4.样品处理：将待测样品处理成适合于CHIP芯片检测的形式。
这可能涉及样品的纯化、浓缩、稀释等步骤，以确保样品中目标物质的浓度在合适的范围内，并且不会影响后续的分析步骤。
5.样品加载：将经过处理的样品加载到CHIP芯片上，通常通过微流控系统控制样品的注入和流动。
在样品流过芯片表面时，目标分析物质与已固定化的分析物质发生特异性的结合反应。
6.控制实验条件：在实验过程中，需要控制一些实验条件来提高分析的准确性和灵敏度。
这包括温度、压力、流速、反应时间等。
适当的实验条件可以确保后续的分析步骤能够准确地进行并且结果可靠。
7.反应和检测：待测样品与固定化的分析物质发生特异性的结合反应后，可以使用不同的检测方法来检测和测量结合事件。
常用的检测方法包括荧光检测、生物传感器、质谱分析等。
根据实验需求，选择适当的检测方法来获得精确的分析结果。
8.数据分析和解释：将检测到的数据进行分析和解释。
通过比较样品与对照组的差异，可以获得目标物质的定量或定性信息。
根据实验设计，可以利用统计学方法来确定结果的可信度和显著性。
ChIP_原理及实验方法
ChIP_原理及实验方法ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与染色质之间的相互作用。
它可以帮助我们了解基因的表达调控机制，以及特定蛋白质在染色质上的分布情况。
本文将详细介绍ChIP的原理及实验方法。
一、原理ChIP实验的基本原理是通过交联染色质上的蛋白质与DNA分子，然后用特异性抗体将蛋白质-DNA复合物沉淀下来，最后通过PCR或测序等方法检测目标DNA序列的富集情况。
ChIP实验的步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤和DNA分离等。
具体步骤如下：1.交联：将细胞或组织进行交联，使得染色质上的蛋白质与DNA形成稳定的交联复合物。
常用的交联剂包括甲醛和二甲亚砜。
交联后，用甲醛或二甲亚砜进行破交联，使得蛋白质与DNA分离。
2.裂解：将细胞或组织裂解，释放出染色质，并将染色质切割成适当的片段。
常用的裂解方法包括机械裂解、酶裂解和超声波裂解等。
3.免疫沉淀：将特异性抗体与染色质中的目标蛋白质结合，形成蛋白质-DNA复合物。
免疫沉淀的条件需要优化，包括抗体浓度、缓冲液成分和温度等。
4.洗涤：将免疫沉淀得到的蛋白质-DNA复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
5.DNA分离：将洗涤后的蛋白质-DNA复合物进行解交联，并纯化出目标DNA序列。
常用的方法包括蛋白酶K处理、蛋白质酶解和PCR等。
二、实验方法ChIP实验的方法流程如下：1.细胞或组织处理：根据研究目的，选择合适的细胞系或组织样本，并进行相应的处理。
例如，可以添加药物、诱导表达或处理刺激等。
2.交联：将细胞或组织用1%甲醛溶液交联15-30分钟，停止交联反应，然后加入0.125M甘氨酸进行孵育10分钟。
3.裂解：将细胞或组织裂解，释放出染色质。
可使用适当的细胞裂解缓冲液，如SDS缓冲液、NP-40缓冲液或胶体缓冲液。
4. 切割染色质：使用限制性内切酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
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chip基本实验步骤
基本实验步骤
(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;
(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)免疫沉淀反应后，在4?C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟;
(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理:
免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4?完成外，最为关键的是裂解液的成份。
用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。
我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。
a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。
然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。
因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。
c. 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作
用。
一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。
d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从
而释放了其中储存的许多蛋白酶。
而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。
还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。
因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。
一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。
e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。
不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:
- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。
- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对
这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。
- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一
样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。
而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。
二、抗体-agarose beads孵育
裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80?保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。
抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜，也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。
一般选择1mg 总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体，最高可以添加至5 ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。
这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。
一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。
例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。
同时，为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein A或者G beads 与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。
同时，Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。
一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。
三、抗体-agarose beads复合物洗涤:
除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。
一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。
针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。
例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低
浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。
四、鉴定
免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。
我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验
环节。
由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。
其中，抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起，只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。
因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。
这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。
因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。
通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug)，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。
针对上述情况，通常有二种解决办法:
a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。
b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物，最后离心去除抗体-agarose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。