RNA提取方法及原理

操作步骤
（一）动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、 动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫 克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆
动植物组织mRNA提取
一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻 真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶 （180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体 积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温 灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于 低温冰箱。 3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris· Cl(pH7.6)， 0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。 4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris· (pH7.6)，1mmol/L Cl EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
不同丰度
组织名称 肝脏
样品 量
1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg
总RNA含量
1.2 RNA分布
高丰度
脾脏 心脏 大脑 胚胎 肾脏 肺
2-4μg
中丰度
0.05-2μg
膀胱
低丰度 骨 脂肪 高丰度 中丰度 低丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片
1mg
1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.5-1μg 0.5-1.5μg 0.2-0.5μg 0.05-0.1μg 0-0.05μg
2.4 几种RNA提取方法 2.4.1 TRIzol法
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试 剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯 仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层 中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来 还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以 沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机 层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标 准化RNA的产量十分有用。
谢 谢
4、取水相，加入1/10倍体积的 3mol/LNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混 匀，-20℃30分钟。 5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液， 用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。 6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气 干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲 液中。 7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合 成。
RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得
RNA纯化要求
1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质
2 排除有机溶剂和金属离子的污染
3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染
2.2 RNA提取的注意事项 2.2.1 杜绝外源酶的污染 一：严格戴好口罩，手套。 二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆， 电泳槽，实验台面等要彻底处理。 三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必 须确保 RNase-Free。
吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放 置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心 5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各 洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保 留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重， 记录。
2、方法及原理
2.1 RNA的提取流程
1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得
RNA提取流程－－ 样品前处理注意点
选择新鲜血液，不得超过4小时
选择新鲜组织，生长旺盛的组织
选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞
RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本
可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间
操作步骤
1、取一eppendorf管加入提纯TMV （10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧 管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10 分钟。 2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽 提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯 仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心 10分钟。
异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA
1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至 粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每 管0.5mL。 2） 置于冰上，顺序加入：50μl 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水 饱和酚， 170μl CI，混匀。置冰上15min。 3） 各管平衡后，4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一 管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或 －80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 4） 用70％乙醇洗一次，4℃，12 000g离心5min。吸去乙醇， 空气中吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液，65℃吹打 RNA沉淀溶解。
苯酚法提取酵母RNA
取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液 使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半）， 加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱 和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃ 低温环境下，10000r/min 离心10min。吸出上层清液，转 入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈 振荡2.5min，然后10000r/min 离心5min。
5） 加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃ 沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 6） 用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC －H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。 其余加2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。 7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂 糖凝胶电泳分析完整性。
实验流程图
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
有机相
pH5.7
2.4.2 苯酚法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白 的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并 除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧 裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水 相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面 处形成凝胶层。
RNA提取方法及原理
John
1、研究背景
1.1 RNA研究的重要性
DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是 生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要 性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大 类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥 不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传 信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻 重。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。 5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注 意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行 mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下 操作。 2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉 淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年
TRIzol法提取流程
1 ． 样品处理： （１）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中， 加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。 （２）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存 的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室 温静置５ min 。 2 ．加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 15min ，取上清。 4 ．加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。 5 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 10min ，弃上清。 6 ．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 7500g × 5min ， 弃上清。 7. 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。
推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存
液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间
RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA
异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂
胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂
2.2.2 阻止内源酶的活性 一：选择合适的匀浆方法。 二：选择合适的裂解液。 三：控制好样品的起始量。
2.3 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶
2.4.3 异硫氰酸胍—酚法
异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯 基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨 酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸 性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下 来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较 适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。
植物病毒的RNA提取
大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极 性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取 较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意 结果。
一、材料 提纯TMV病毒液（10mg/ml）。 二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳 仪，电泳槽。 三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓 冲液，无RNA酶的双菌水。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入 1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体 积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟，然后以每 1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用 手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离 心10分钟。