蛋白质双向电泳简介
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
蛋白质双向电泳简介
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支架
水合溶液：
8M
尿素
2%
NP-40 或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
水合目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
IPG 胶条的平衡
平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗
SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解 性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质 变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基
因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰 双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂 类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导 致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制 备的药剂必须与等电聚焦兼容。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
2-1 蛋白质双向电泳
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是
尿素和硫尿。
• 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团 后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢剂有离子 去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去垢剂 CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
• 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的 上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推， 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
• 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的
蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基 乙醇，以及不带电荷的三丁基磷（TBP）进行还原。
• 起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存
在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保 持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发 生沉淀。 • Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分， 从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应 小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
• 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的 上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推， 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
Western-Blot-蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳
*双向电泳技术在蛋白质组学中发挥着重 要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同 样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作 用、蛋白质修饰等。 *在人类恶性肿瘤的研究中，人们可以通 过双向电泳技术分离正常组织细胞和肿 瘤细胞之间的差异蛋白质组分，在寻找 肿瘤特异型标志物，解释肿瘤发病机制 及治疗方面有极大作用。 *双向电泳的出现，为动态、高通量的研 究药物作用机制提供了强有力的支持。
操作步骤
Western blot
Westernblot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学 中时常会用到的一种实验方法，蛋白质分析中应用的W estern杂交法是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相 支持体，并以针对特定氨基酸所制备的特异性样品作为 探针检测其相同或相似序列。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是 蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗它与 附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异 性反应。它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提 物中检测和识别几种特异的蛋白质。 这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水 平而又无需免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标 记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的 某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有 用
应用
谢谢观看
Step-n- 1 hr
hold
hold
200
Step-n- 1 hr
8000
Gradient 3 hr
hold
500
Step-n- 1 hr
hold
（4）IPG 胶条的平衡
• 将胶条放入平衡缓冲液Ⅰ中，封口，在摇床上振荡15 min。
• 将胶条取出放入平衡缓冲液Ⅱ中，封口，在摇床上振荡 15 min。
蛋白质的双向电泳
分子量 提取的总蛋 白溶液 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同 位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱 考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记 将标记的 样品混合 样品2： Cy5标记
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描ຫໍສະໝຸດ 图像重叠分析蛋白质双向电泳
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的 定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能
技术流程
提出 生物学问题 实验组和对照组 样品制备 凝胶图像分析
双向电泳(2DE/DIGE)
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡，以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合，保证SDSPAGE电泳的顺利进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而 分离，与普通SDS-PAGE相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为 第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓 缩
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 尽可能简单的操作步骤，注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰，去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电 点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平 和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性， 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢 失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度 来确定。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。
通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。
然后把差别点切出，进行脱色、酶解。
最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。
通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。
原理：
1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。
样品要求：
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2ug/ul；
由于蛋白质组学涉及的样品范围很广，对于具体样品的要求请和项目经理联系。
仪器：
1st dimension:第一项
IEF:IPG-PhorII(GE)and Protean IEF(BioRad) Bio-Rad Model111Mini IEF Cell
2nd dimension:第二项
GE Ruby SE600(16x16cm)
GE Ettan DALTsix(26x20cm)
BioRad Criterion pre-cast(13x9cm)
BioRad Protean(8.6x7cm)
2D凝胶图像识别软件
Image master2D Elite®
实例分析。
《蛋白质双向电泳》课件
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
质谱鉴定双向电泳蛋白
百泰派克生物科技质谱鉴定双向电泳蛋白双向电泳即双向凝胶电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，以实现更精确的鉴定。
百泰派克生物科技提供双向电泳获得的兴趣蛋白的质谱鉴定服务。
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis），也称作双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis）或二维凝胶电泳，缩写为2-DE或2-D电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
双向电泳是等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-PAGE的结合。
蛋白质混合物在二维凝胶上，首先根据pH值对蛋白质进行等电聚集电泳分离，之后根据蛋白质分子大小进行SDS-PAGE分离。
双向电泳完成后，将凝胶进行染色即可得到一个蛋白质二维分布图。
常用的染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、负染和荧光染色。
双向电泳中，通过在电泳时在一条泳道上添加已知相对分子质量的一系列标准蛋白质，可以对样品中的蛋白质的相对分子质量进行估算。
质谱鉴定双向电泳蛋白通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，从而实现目标蛋白的精确鉴定。
对于Coomassie Blue，SYPRO Ruby以及Silver stain染色的样品，均可通过质谱进行蛋白的鉴定。
但是，银染的样品有可能会与质谱分析不兼容，推荐使用以下产品或者实验步骤进行银染实验：ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)；Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)。
此外，用于质谱鉴定的银染样品不要进行脱色处理。
双向电泳培训课程PPT课件
优化电泳条件
优化电泳参数，如电流、电压和 时间，以获得更好的分离效果。
提高检测灵敏度
采用荧光标记技术
利用荧光标记技术对蛋白质进行染色，提高检测 灵敏度和分辨率。
优化染色方法
改进染色步骤和条件，降低背景噪声，提高检测 灵敏度。
开发新型检测器
研发更灵敏的检测器，提高检测下限，降低检测 误差。
自动化与智能化发展
设置参数
根据实验需求设置电泳参 数，如电流、电压、时间 等。
开始电泳
接通电源，启动电泳程序， 开始电泳分离。
染色与检测
固定
电泳结束后，将凝胶固定在染色 架上，用脱色摇床进行固定。
染色
根据实验需求选择合适的染色方法， 如银染、考马斯亮蓝染色等。
检测
通过凝胶成像系统或数码相机对染 色后的凝胶进行拍照和记录，以便 后续分析。
03
比较不同物种间蛋白质的差异，揭示生物进化的奥秘。
临床应用前景
个体化医疗
通过对个体蛋白质组的分析，为个体化医疗提供依据。
精准诊断
利用蛋白质组学技术对疾病进行精准诊断，提高诊断的准确性和 可靠性。
药物疗效评估
通过监测药物治疗前后蛋白质组的变化，评估药物疗效和安全性。
THANKS FOR WATCHING
高分辨率和高灵敏度检测技术
提高蛋白质的检测灵敏度和分辨率，有助于发现 更多蛋白质。
3
生物信息学
对蛋白质组学数据进行深入分析，挖掘更多生物 学意义。
蛋白质组学研究
疾病标志物研究
01
寻找与疾病相关的蛋白质标志物，为疾病的诊断和治疗提供依
据。
药物靶点研究
02
发现潜在的药物靶点，为新药研发提供支持。
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
蛋白检测篇-双向凝胶电泳分享
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：营养知识饮食原则：三高三低（高蛋白/高纤维/高维生素，低糖/低脂肪/低盐）人体六大营养元素脂肪/蛋白质/碳水化合物维生素/矿物质/水比例：脂肪：蛋白质：碳水化合物=1：2：3一、脂肪的作用保护内脏/储存能量/维持神经系统的正常功能/防寒保暖/帮助荷尔蒙的产生/能量的来源之一/支持组织的生长/保护和修复注：脂肪是能量储存的最有效的方式，一克脂肪含热量9.3千卡。
双向电泳
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2D 电泳优越性●对未处理样本耐受性好●不需要预纯化(如：色谱层析)●分辨率非常高●2D 可以有效的组分收集器●蛋白在凝胶介质中受到保护●在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）●与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多●与后续分析技术兼容性好一、基本原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH 梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。
然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。
样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。
值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。
根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。
第一向：等电聚焦1．[基本原理]从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。
蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。
由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。
构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。
蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric pointpI）。
蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。
实验八 蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳【实验目的】1、学习和掌握蛋白质双向电泳的基本原理和方法。
2、了解双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用。
【实验原理】蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF），根据蛋白质的等电点（pI,isoelectric point）不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按蛋白质亚基分子量大小(Mr, relative molecule)进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
等电聚焦(IEF, isoelectric focusing)是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。
蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。
如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。
这个过程称作等电聚焦，蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂（DTT，二硫苏糖醇）则能使半光氨酸残基之间的二硫键段裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。
解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种分子生物学技术，早期于1980年被开发出来，目的在于研究从蛋白质到核酸的分子形式。
它成功地用电场来完成蛋白质和核酸的迁移。
它可以生物学物质之间进行重要的调查和研究，它对生物分子的结构和功能提供了有用的信息。
双向电泳是一种电泳技术，它可以将分子物质从一个电极移动到另一个电极，将它们分开，从而可以生物学实验过程中的分子物质进行调查和研究。
它的基本原理是利用电场的力来引导电荷密度的分子经过一个单独的电极，从而将它们分开。
由于电泳法中的电场有一定的方向性和强度，因此，电荷密度不同的分子会由于电场的影响，在施加了强电场的电极之间移动。
双向电泳的核心部分是一个称为磁控电泳仪的仪器，它具有一对可旋转的电极，可以施加随时间变化的电场强度，它还具有调节电场强度的功能，以满足研究需求。
一般来说，双向电泳的原理是通过将悬浮液加入电极室中，再施加适量的电场，将电荷密度不同的分子分开，其中电荷密度较高的分子朝着电极移动，而电荷密度较低的分子则会朝着电极反向移动，以此进行分离。
另一方面，双向电泳中也可以使用不同类型的电极液体，如酸性液体和碱性液体。
当电极液体的酸碱性发生变化时，它会影响分子的移动方向，从而影响分子的分离效果。
双向电泳技术可以用于核酸和多肽的分离，也可以用于水溶液中的分子的分离。
双向电泳的应用非常广泛，它可以用于对各种生物分子的结构和功能关系的研究，为医学和生物科学的发展提供帮助。
双向电泳是一种新型技术，它具有高通量分析、低成本、易于操作等特点。
它可以在短时间内分析大量样品，而且相比传统的技术，它也更加准确、可靠。
双向电泳技术也正在广泛应用于基因组学、蛋白组学、工业过程中的分子序列定位、癌症诊断、药物毒性测定等方面。
因此，双向电泳技术的应用和神奇的效果在生物医学研究中已经被越来越广泛地认识和使用。
未来，双向电泳技术将会成为进行生物学研究所必不可少的工具，为研究生物分子的结构和功能提供新的方法。
双向电泳的主要应用
双向电泳的主要应用双向电泳是一种常用的蛋白质分析技术，具有广泛的应用领域。
本文将介绍双向电泳的主要应用，并探讨其在生物医学研究、生物工程和食品安全等领域的重要性。
双向电泳在生物医学研究中扮演着重要的角色。
通过双向电泳，研究人员可以分析蛋白质样本中的不同成分，并研究它们在疾病发展过程中的变化。
例如，在癌症研究中，双向电泳可以帮助鉴定肿瘤标记物，从而提供早期诊断和治疗的依据。
此外，双向电泳还可以用于研究神经退行性疾病、心血管疾病和代谢性疾病等方面，为疾病的机制研究和新药开发提供重要的支持。
双向电泳在生物工程领域也有广泛的应用。
通过双向电泳，研究人员可以分析蛋白质样本中的不同组分，并研究它们在生物工程过程中的变化。
例如，在生物药物研发中，双向电泳可以用于分析重组蛋白质的纯度和结构，确保产品的质量和安全性。
此外，双向电泳还可以用于研究基因表达调控、蛋白质互作网络和细胞信号传导等方面，为生物工程的优化和创新提供重要的指导。
双向电泳在食品安全领域也发挥着重要的作用。
通过双向电泳，研究人员可以分析食品样品中的蛋白质成分，并检测其中是否存在有害物质或污染物。
例如，在食品质量监测中，双向电泳可以用于鉴定食品中的过敏原或毒素，确保食品的安全性。
此外，双向电泳还可以用于研究食品加工过程中的蛋白质变化和食品中的营养成分，为食品工业的改进和创新提供重要的依据。
双向电泳作为一种重要的蛋白质分析技术，在生物医学研究、生物工程和食品安全等领域具有广泛的应用。
通过双向电泳，研究人员可以深入了解蛋白质样本的组成和变化，为疾病诊断、药物研发、生物工程优化和食品安全监测提供重要的支持。
随着技术的不断发展和创新，相信双向电泳在更多领域中的应用将会得到进一步拓展，为科学研究和社会发展做出更大的贡献。
成都双向电泳原理
成都双向电泳原理
双向电泳又称双向荧光电泳，它是一种建立蛋白质复合体的快速高效的结构分析技术。
通常称其为“成都双向电泳”，是因为第一次发明该技术的实验室位于四川省的成都市。
双向电泳的原理是利用电压场将蛋白质复合物强行向特定方向移动，同时利用荧光分子实时追踪复合体的运动过程。
该技术通常需要使用特殊的双向电泳场，由于其高度特殊化的复杂电路，许多实验室仍然使用通用的双向电泳仪器来实现向上运动和向下运动的电泳研究。
双向电泳的分析主要是靠采用双向电泳场来跟踪复合体的运动，由此得出蛋白质复合体的大小、重量以及蛋白质结合模式等信息。
通过向复合体施加电压，使得它在双向电势场中开始运动，能够把复合体融合在电场中，追踪指示物荧光分子的不同位置，从而或者向下分解复合体，或者是进行二级结构构象。
双向电泳不仅能用来分析一般的蛋白复合体，还可以用于探索复杂的蛋白复合体，建立它们的精确结构。
另外，双向电泳还可以被用来分析复杂的大分子间的作用，比如RNA-protein复合体和Protein-protein间复合体。
此外，双向电泳技术在类肽及多肽抗体开发，药物研究，药物筛选，小分子抑制剂的研究中也都有着重要的作用。
因此，双向电泳不仅仅是一种结构分析技术，它也可以被用来研究复杂的大分子间的相互作用，并且是理解大分子结构及功能的重要手段。
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SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析
蛋白质双向电泳简介
2020年4月20研究中最常用的技术,具有简便 、快速、高分辨率和重复性等优点。1975年,意大利生 化学家O.Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白质 分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了快四十年的 发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上仍未改 变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条水合、等 电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE电泳等步骤 。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差 异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术
在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性 为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质变性 成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基因序列
匹配。二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳 的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂类、多糖和 核酸等)和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽 或蛋白修饰。此外,用于样品制备的药剂必须与 等电聚焦兼容。
还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂 可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自 由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（ TBP）进行还原。
管状胶条的制备 :
去离子水2.1ml 30%丙烯酰胺 0.8ml 两性电解质 280ul 尿素3.15g,水浴使 尿素溶解。
20%NP- 40 0.3ml 10%过硫酸铵20ul
TEMED 2.5ul 摇匀后水平注入内径为 1mm 的玻璃管内, 上端留有 一定空间静置待凝, 每次可灌6—8 根。
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后 ，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表 面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100 和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中 CHAPS和SB3-10最好。
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位 、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究 最终确定它们的功能
仪器设备
原理
双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群 的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学 原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电 点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质 进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之 分离。
样品的制备
取材时应避免因细胞死亡而引起蛋白降解,尽 可能快速将材料投入液氮中保存。研磨时,组织 样品须在液氮中冷冻,充分研磨成细粉,然后快速 加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,充分混匀。对于 大多数植物样品制备而言,在液氮磨碎的样品中 应快速加入蛋白沉淀剂(如丙酮),并在低温下沉淀 (-20oC)和离心(4oC)。
IPG干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶 共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即使 胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳定的 pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPG胶灌注在塑料 片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成固定大小
而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现性有明显提 高,主要是因为使用了预制的SDS-PAGE胶和灌制多板 胶的设备,实现了实验系统的标准化,便于实验室内部及 实验室之间数据比较和合作。
样品的溶解
2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶 解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合 物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解 液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的 点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能 干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质 的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中 保持溶解状态。
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂的 裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可用裂 解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基质以维 持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂尿素和硫 脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以打断蛋白质 样品中的氢键结构。使用非离子型或两性去污剂 以破坏疏水交互作用。
要用到的试剂
样品裂解液: 7mol/L尿素,4% CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。 IPG溶胀液: 8mol/L尿素,2%CHAPS,分装成0.5ml/管,-20oC保存。 使用前2.5ml IPG溶胀液加入7mg DTT,0.5%IPG缓冲液(3~10L),少量 溴酚蓝。 平衡液: 50mmol/LTris-HCl (pH8.8),6 mol/L尿素,30%甘油,2% SDS,少量溴酚蓝。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。 溴酚蓝溶液 :1%溴酚蓝,50mmol/LTris-HCl,分装成0.5ml/管,-20oC 保存。 30%丙烯酰胺贮存液: 30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺,0.45um 微孔滤膜过滤后,避光贮存于棕色瓶中4度保存。 凝胶缓冲液储存液： 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8),0.45um微孔滤膜 过滤后,4度保存。 SDS电泳缓冲液 :25mmol/L Tris-HCl (pH8.3),192mmol/L甘氨酸 ,0.1%SDS