华东理工大学分离分析化学论文

亲和层析法的简介柴先志10100437（华东理工大学上海 201424）摘要：亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点，已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。

本文综述了亲和层析的类型、实验研究以及亲和层析技术的进展和应用。

关键字：亲和层析种类实验研究应用进展The brief introduction of affinitychromatographyChain Xianzhi 10100437(East China University of Science and Technology,Shanghai 201424) Abstract: Affinity chromatography is one of the most efficient techniques in biological macromolecular separation and purification which has the advantages of high specificity, high recovery efficiency, high purity and single-step operation. The developments and applications of affinity chromatography, the types and the experiment researches are introduced in this review.Key: Affinity chromatography; Types; Experiment researches; Applications; Development亲和层析是利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的—种层析技术。

可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。

如用寡脱氧胸苷酸一纤维素分离纯化信使核糖核酸；用DNA一纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖一抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。

亲和层析技术的最大优点在于利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质。

该技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物质，而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。

利用亲和层析技术已成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品因此可以说亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。

1.亲和层析的种类亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析成功的关键因素。

根据配体与生物大分子之间相互作用体系不同，可以把亲和层析分为以下几种类型。

1.1生物亲和层析生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。

通常具有高的选择性。

典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。

1.2免疫亲和层析利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。

免疫亲和层析应用相当广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体，目前，利用抗体-抗原模式，有可能得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基，通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。

此种方法的纯化倍数活性回收率非常高。

蛋白A和蛋白C作为抗体结合蛋白已被应用于免疫亲和层析技术。

1.3固定化染料为层析剂进行亲和层析的方法活性染料是—类合成化合物。

由于其中有—些与生物大分子物质能够产生可逆的、转移性结合，因此它们在生物亲和层析技术发展中有着重要的意义。

活性染料与生物大分子物质的亲和关系是一个偶然发现。

在凝胶过滤法中要用到一种高分子量的可见标记物——蓝色葡聚糖，以量度柱中空隙的体积。

过滤分离中，发现这种蓝色标记物的存在会使凝胶过滤的预期结果出现异常。

分析后发现，丙酮酸激酶完全为蓝色葡聚糖所吸附。

因此发现了利用合成活性染料作配基用于亲和色层分离的方法。

2.亲和层析的实验研究2.1 金属螯合亲和层析法分离蛋白的实验研究以单组分蛋白质牛血清白蛋白(BSA)和血红蛋白为研究对象，考查pH 值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。

对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行研究,比较不同金属离子与蛋白质亲和力的区别,为实际生物产品的分离奠定基础。

在金属螯合亲和层析柱上以BSA 为对象进行了各种洗脱因素的研究,结果表明，pH 值降低，或者铵离子浓度的升高都有利于蛋白质的洗脱,此结论与蛋白质在金属离子螯合层析中吸附及解吸的机理相仿。

在洗脱过程中不同铵盐的作用效果不同,弱电解质体系有利于氨分子的形成。

当pH 值与NH共同作用时，氨分子浓度对洗脱的影响强于氢离子浓度。

4用锌柱与铜柱对BSA 的洗脱性能进行了对比,研究表明,铜离子与蛋白质结合的稳定性要大于锌离子与蛋白质结合的稳定性。

并用价键理论解释这一实验现象。

在IDA2Zn 柱上对不同蛋白质洗脱效果进行的对比研究表明,血红蛋白在锌柱上保留性要大于牛血清白蛋白。

这表明不同性质的蛋白质与金属离子的亲合力是不同的,这种区别取决于蛋白质表面吸附基团的数量以及它们的空间分布。

本文的研究结果为今后实际体系的分离奠定了一定的基础。

2.2 乙型肝炎病毒PreS基因的克隆表达及亲和层析纯化的实验研究利用乙型肝炎病毒基因组为模板体外扩增BVPreS基因后进行基因克隆。

目的基因经测序正确后克隆入融合表达载体pRSET-C中转化大肠杆菌JM109(DE3) 。

目的基因经IPTG诱导由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的BV-PreS蛋白在变性条件下对目的蛋白进行纯化。

结果可成功地扩增到preS 区全长基因得到融合6个His的BV-PreS蛋白纯度大于90%。

以此构建了乙型肝炎病毒前S区基因的重组表达载体，获得了稳定表达的工程菌，为以后的深入研究奠定了基础。

其中亲和层析的操作是：从重组菌中制备的包涵体经洗涤后，用8 mol- L-1 尿素变性，上到Ni- NTA 金属螯合亲和层析柱上。

由于pRSET-C 质粒多克隆酶切位点上游插入编码6个连续组氨酸残基的序列( 6x~is tag) ，在重组质粒进行诱导表达时，6x~is tag 与外源插入片段共同表达，因而融合蛋白带有6x~is tag ，后者可与金属镍发生螯合，从而使目的蛋白在流经柱床时被特异性吸附。

再利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。

15%的SDS-PAGE(Fig 5)证明了这种方法的有效性，经薄层扫描分析融合蛋白纯度可达90%以上。

2.3 凝集素亲和层析分析血清GGT寡糖链结构的实验研究以唾液酸酶水解GGT糖链末端的唾液酸，再用DSA和ConA亲和层析柱对各种肝病患者血清GGT进行洗脱，结合两种凝集素结合糖链的特性，分析其糖链结构。

结果得到，血清经唾液酸酶水解，再用两种凝集素亲和层析后，发现肝病患者GGT糖链结构均有所变化。

N糖链天线数：肝癌>良性肝病>正常人,糖链末端唾液酸量:肝癌>良性肝病>正常人。

肝癌病人出现和DSA强结合组分，该组分不被ConA结合。

结论是肝癌病人血清GGT可出现和DSA强结合的三天线或四天线N糖链，可利用这一特点建立检测肝癌特异性GGT的凝集素亲和小柱层析法。

2.4 以硅胶为载体的交联壳聚糖作为亲和层析填料基质的实验研究采用硅胶为载体的交联壳聚糖（CTS-SiO2）作为亲和层析填料基质，对其卵清蛋白的偶联能力，以及亲和纯化小鼠抗卵清蛋白抗体效果等进行研究。

结果显示卵清蛋白能方便地用戊二醛偶联于CTS-SiO2基质，该新型亲和层析填料稳定性高，选择性好，非特异性吸附小，每克交联壳聚糖上可偶联卵清蛋白54.25mg，用该填料可有效地亲和吸附小鼠抗卵清蛋白抗体，并可用碱性缓冲液将该抗体洗脱，初步显示出较好的分离纯化效果。

与单纯壳聚糖作亲和层析填料相比，其壳聚糖用量少，成本大大降低。

另外由于交联壳聚糖包在硅胶表面，有可能使该填料有较高的耐压性。

2.5 茶叶-葡萄糖苷酶亲和层析纯化与性质的实验研究以化学合成的β-葡萄糖苷酶的抑制剂β-葡萄糖脒为配体，通过N-糖苷键交联到支持物上，使糖脒N-糖苷键一侧的氨基保持带正电荷的活化状态，合成了一种β-葡萄糖苷酶的亲和层析树脂。

这种合成的亲和层析树脂在弱酸条件下非常稳定，能选择性地吸附β-葡萄糖苷酶，并能多次重复使用利用。

利用这种亲和层析树脂，在pH6 和pH5 条件下，从薮北种茶树叶片中纯化出两种分子量分别为63 和75 kDa 的β-葡萄糖苷酶单体酶。

以对硝基苯酚β-葡萄糖苷为底物,研究了两种酶的性质。

TLC分析结果表明，这两种β-葡萄糖苷酶都能水解(Z)-3-己烯醇、苯甲醇和苯乙腈的β-D-葡萄糖苷。

3.亲和层析的实际应用3.1亲和层析在蛋白质组学中的应用蛋白质组学最常用的实验技术是用于分离蛋白的双相电泳（2-DE）和用于鉴定被分离蛋白的质谱（MS）技术。

然而亲和层析也是起很大作用的分离方法。

蛋白被2-DE分离之前，亲和层析主要被用作选择性地预先浓缩和预处理样品。

其应用包括去除一种或一类会干扰2-DE的分辨率的蛋白，一个典型的例子是血清及脑脊髓液样品的白蛋白和免疫球蛋白1gG的去除，是通过吸附在亲和树脂上的方法进行的，这样可显著提高2-DE胶上蛋白斑点的分辨率。

另外，亲和层析可浓缩低丰度的蛋白，这样它们就可在2-DE胶上被看到；还可将所有蛋白分类成两组或几组以便进一步分析。

3.2分离纯化目的蛋白、定量测定近年来，高速发展的生物制药工业已广泛应用亲和层析技术作为其重要的分离纯化和定量测定用于临床药物的工具。

亲和层析最常用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化上。

特别在融合蛋白的分离纯化上，亲和层析更是起到举足轻重的作用，因为融合蛋白具有特异性结合能力。

亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用相当广泛，其中，以对分别带有（His）和GST亲和标记的融合蛋白的抗原Ni 2-NAT和GST亲和层析应用相当广泛。

金属螯和层析与免疫亲和层析也得到一定的应用。

3.3生物分子间相互作用的鉴定亲和层析也被用来研究生物系统中生物分子间发生的相互作用。

该领域已被用来检验各种生物系统，包括凝集素lectin/糖，酶/抑制剂，蛋白/蛋白，以及DNA/蛋白间的相互作用。

临床上主要将该技术用于研究药物或激素与血清蛋白间的结合。

两种层析方法可用来研究生物间相互作用。

一种是zonal洗脱研究，另一种是前沿frontal分析研究。

3.4亲和层析与其他分析技术相结合近年来的另一发展趋势是寻求更加优化的系统设计和安排形式，从而获得快速、优良的选择性以及很大数量被检测的样品。