第十三章 生物芯片及数据分析技术

基因芯片的分类：
表达谱芯片（最常用） 测序芯片 按用途： 检测芯片（病原体检测、检疫芯片） 诊断芯片 毒理芯片等 寡核苷酸芯片 cDNA芯片 基因组芯片等
按探针性质
基因芯片技术基本操作
① 基因芯片制备
就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针通 过一定的方法固定到固相支持物上。 主要有两种：原位合成法和直接点样法
对核酸序列分析与测定提出的新要求
• 速度快、效率高 • 高通量（可同时对大量核酸序列进行检测和分析） • 操作简便、自动化程度更高 • 成本低
• 生物芯片技术正是在这样的背景下应运 而生。
生物芯片（biochip）
• 杂交技术与半导体工业技术相结合 • 又称生物微阵列（biomicroarray），是以生物分子相互 作用特异性为基础，将一组已知核酸片段、多肽、蛋白 质、组织或细胞等生物样品有序固定在惰性载体（玻片、 硅片、滤膜等，统称基片）表面，组成高密度二维阵列 的微型生化反应分析系统。
人类基因组计划主要研究内容
• 物理图谱：以基因或一段 • 以遗传标记为位标、以遗传 学距离为图距绘制。 已知核苷酸序列的DNA片 • 染色体DNA的全部碱基序 段（称为序列标签位点， 列（也是分辨率最高的物 sequence tagged site，STS） • 反映基因、DNA多态性等 理图谱）。 遗传标志在染色体DNA上 为位标、实际距离（位标 的相对位置、连锁关系。 间隔的碱基对数）为图距 • 遗传图谱、物理图谱、转 绘制。 录图谱等的信息均可以整 • 单位：厘摩（centi-Morgan, 合到序列图谱上，是一般 cM）。连锁的遗传标志之 • 转录图谱（表达图谱）： 意义上的人类基因组计划。 间的重组频率为1% 时，它 以基因（以外显子或表达 序列标签EST为标志）为位 们的相对距离为1cM， 相 标、实际距离为图距绘制， 当于106 bp(1Mb)。 是遗传图谱与物理图谱的 统一。
表 健脾益气法相关差异基因GO分类（DAVID 6.7）
KEGG pathway分析
——包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信 号传递、细胞周期，及同系保守的子通路等信息
常用数据库： • DAVID、BIORAG（Bio
Resource for Array Genes）等
表 健脾益气法相关差异基因信号通路分析（DAVID 6.7）
詹姆斯·沃森基因图谱的一部分
人类第一份完整的个人基因组图谱
基因组学与功能基因组学
• 对人类基因组的研究推动了整个生命科学的 发展，同时也形成一门崭新的科学——基因 组学（genomics），即研究基因组的组成、结 构、功能及表达产物的学科。 • 基因组研究主要包括两方面的内容：以全基 因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基 因组学（functional genomics)，又被称为后基 因组（postgenome）研究。
每个探针点的Flag值/Call值：表达谱芯片中常用A、 P、M来表示该探针点信号与背景信号的差异 ——A-Absent：无显著性差异 P-Present：有显著性差异 M-Marginal：差异介于A和P之间 ——要求比较的两组，至少有一组内不出现A
视图分析
散点图（Scatter plot）
蛋白质芯片信号的检测
• 对吸附到蛋白质芯片表面靶蛋白的检测主要有两 种方式 ： 1.以质谱技术为基础的直接检测法〈如表面增强激 光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI - TOF MS)〉
图1 亚健康状态中部分阳虚质患者血清蛋白质图谱
图2 亚健康状态中部分阴虚质患者血清蛋白质图谱
由峰值强度反映组间具有相同质荷比（M/Z）蛋白质的含量差异
深入分析：涉及Gq蛋白激活的花生四烯酸-HETEs 代谢通路
蛋白分子相互作用分析
常用数据库： • STRING 、pSTIING等
String9.05在线分析
pSTIING在线分析
单基因分析
常用数据库： • 美国国家生物技术信息中心（NCBI） • 欧洲生物信息研究所（EBI）
蛋白质芯片技术
基因组学与功能基因组学
• 转录组 • RNA组（非编码RNA） • 蛋白质组
人类基因组计划催生了大量生物数据
GeneBank数据的快速增长
怎样去研究如此众多基因的生物信息及其 在生命过程中所担负的功能，成了全世界 生命科学工作者共同的课题！
传统核酸印迹杂交的局限性
• 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 • 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、 低通量(low through-put)等
火山图（Volcano plot）
聚类分析将基因与最相关的表达谱放在一起，分析的基础是
总基因组的线性相关。生Hale Waihona Puke Baidu系统的有序性质可以保证聚类分析 方法会揭示出生物行为的有趣特征。
GO（Gene Ontology）分析
——寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功 能的改变有关。 分类： • 分子功能（Molecular Function） • 生物过程（biological process） • 细胞组成（cellular component） 常用数据库： • DAVID、GATHER、PANTHER等
Affymetrix基因表达谱芯片的实验流程
利用DNA芯片进行杂交测序的原理
• 杂交测序技术（SBH）可大规模地检测和分
析DNA的变异及多态性。
突变
疾病诊断
1、用于诊断遗传性疾病
例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片
2、用于病原体的检出和确定
例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出 多种引起呼吸道感染的病原体。
第十三章 生物芯片及数据 分析技术
在20世纪科技史时有两件事是值得大书特书的： （1）微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏 ，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入到每个 家庭； （2）DNA芯片，它将改变生命科学的研究方式， 革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水 平。 ——美国《财富》杂志
蛋白质芯片（Prochip）
——与DNA芯片比较类似，只不过蛋白质芯片利用的是 抗原/抗体、配基/配体（或受体）等蛋白质之间的相互作用。
蛋白质芯片
蛋白质芯片与DNA芯片的差异：
① 制备时的配基不同、固定条件不同 ② 点样密度不同 ③ 结合反应的原理不同 ④ 检测方法基本相同 ⑤ 应用方向不同
蛋白质芯片探针及其标记
3、肿瘤的基因诊断
例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针 集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发 挥作用。
药物筛选
• 利用基因芯片技术可比较正常组织（细 胞）与病变组织（细胞）中大量相关基 因表达的变化，从而发现一组疾病相关 基因作为药物筛选靶标。应用DNA芯片 还可直接筛选特定的基因文库以寻找药 物作用的靶点。
——把生物、化学等领域中所涉及的样品制备、生物化学反应、分离检测等 基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的 生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。
第一节 基因芯片（gene chip）
又称为DNA芯片（DNA chip）或 DNA微阵列（DNA Microarray）。 将大量已知的探针（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于 支持物上，然后与标记的样品DNA按碱基互补配对原则进 行杂交（探针能够在基因混合物中识别出特定基因），最 后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。
生物信息学分析
——基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是 一种相对值。不同芯片之间要经过以看家基因作 为对照的标准化处理才有可比性。
常用GAPDH 或β-actin基因
归一化的数据
1. 差异基因的筛选
倍数差异FoldChange=SignalA/SignalB（即待比 较的两个标准化以后的信号相除所得的值） ——常用标准Ratio（0.5，2.0） 显著性差异p值：进行统计学t检验，p<0.05为显 著性差异，p<0.01为强显著性差异 ——生物学重复不少于3个
蛋白质芯片信号的检测
2.蛋白质标记法： ①荧光标记的芯片既可用激光共聚焦检测，也可用 电荷偶联照像系统（CCD）进行检测 ②酶标芯片显色后用高精度的CCD进行检测 • 常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中， 通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱，再经 相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。
人类基因组计划
人类基因组计划（human genome project, HGP）是 一项国际性科学研究计划，旨在阐明人类基因组30 亿个碱基对的序列，从物理和功能角度发现和定位 人类基因组基因，破译人类全遗传信息，使人类第 一次在分子水平上全面地认识自我。
上世纪70年代，美国投入巨资的“肿瘤计划”搁浅，人们 渐渐认识到，包括癌症在内的各种人类疾病都与基因直接 或间接相关。 1984年，美国能源部（DOE）首次探讨人类基因组DNA进行 全序列分析的前景。 1986年美国生物学家、诺贝尔奖获得者杜尔贝科(R. Dulbecco) 在《science》发表《癌症研究的转折点—— 测定人类基因组序列》（“人类基因组计划的标书” ） 得到热烈响应。 1990年10月1日，人类基因组计划正式启动。 2001年2月，人类基因组序列“工作框架图”公布。 2006年5月，最后一条染色体序列被公布。 2008年1月，个人基因组计划启动。
以表达谱芯片为例： I. 提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性） II. 对提取的mRNA进行纯化 III. 逆转录合成cDNA（可进行PCR以提高灵敏度） IV. 以双链cDNA为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入）
③ 分子杂交
——是已标记的样品与芯片上的探针进行反应后产生一系 列信息的过程。 与传统的核酸分子杂交相同，但要求更高： 选择合适的反应条件、减少生物分子之间的错配率。 考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、 探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结 构的影响。
原位合成法和直接点样法的比较
基因芯片的基本构造
探针 支持物
外观
剖面图
平面局部放大
1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜 2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定 在支持物上，每个位点的序列是已知的
DNA microarrays on glass slides
② 样品制备（DNA、mRNA）
• 根据研究目的不同，蛋白芯片的探针可选 用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。 • 探针的标记主要有：
酶标记（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP） 荧光标记（常用Cy3和Cy5） 化学发光物质标记（如吖啶酯）等
分子间的反应
• 主要有： ①抗原-抗体反应 ②蛋白质分子与其它蛋白分子或与核酸分子之 间的特异性识别结合 ③酶与底物的识别等 • 通过优化合适的反应条件使生物分子间反应处 于最佳状况中，可以减少生物分子之间的错配 比率。
④ 检测分析
——利用专门的芯片扫描仪对杂交结果进行图象采集和 分析。
基因芯片检测结果
红色杂交点：待测样品中 存在该探针基因高表达； 绿色杂交点：对照样品中 存在该探针基因高表达；
黄色杂交点：待测样品和 对照样品中该探针基因均 高表达。
基因芯片技术的应用
• 基因表达分析 • 基因型、基因突变和多态性分析（如DNA 杂交测序） • 疾病诊断：寻找和检测与疾病相关的基因 及在RNA水平上检测致病基因的表达 • 指导用药及治疗方案（尤其个体化治疗） • 药物筛选
——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污 染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。 常用标记物： 生物素 荧光素 (常用)
激发波长554nm，发射 波长568nm，红色荧光
待测样品（用Cy3-dUTP 标记） 对照样品（Cy5-dUTP）
激发波长649nm，发射 波长666nm，绿色荧光
特点：
① ② ③ ④ ⑤ 高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子） 微型化（可装入口袋） 自动化（技术自动化；结果分析
自动化）
低成本（相对于同时进行大量分
子研究而言）
防污染
分类：
DNA芯片（基因芯片） 微阵列芯片 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片
生物芯片
芯片实验室（Lab-on-a-chip）： ——生物芯片技术发展的最终目标。