实验三 动物细胞培养用液的配制
动物细胞传代培养
动物细胞传代培养一、【实验目的】1、掌握消化法细胞传代培养的原理2、了解细胞传代培养所需专用设备、试剂3、学习细胞传代培养操作二、【实验原理】动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。
这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。
80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。
消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。
三、【实验仪器及试剂】仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱试剂：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液其中，二氧化碳培养箱用于开放或半开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出至培养箱中，再通过稳定调节箱中5%的CO2，与培养基中的NaHCO3处于动态平衡状态，使PH保持稳定。
四、【实验内容及步骤】（1）内容成纤维细胞传代培养6天，细胞汇合长满培养瓶底，刚传代好的细胞，圆球型亮圈，呈流动状态，传代培养1天，细胞贴壁，数量还不太多，上皮细胞培养至细胞汇合长满培养瓶底。
1、用酒精棉球擦拭培养用液瓶盖，打开瓶盖在酒精灯火焰上一过，盖上瓶盖，但不必拧紧2、将培养瓶内的旧培养液倒入烧杯中（注意瓶盖在酒精灯火焰附近），旧培养液倒掉后，镜下观察细胞十分干净、清晰3、从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，注意吸管的刻度面向上，加样器的柄面偏左侧，以便于操作时观察。
4、将吸管过火焰（竖向横向各过一到两次），吸取PE液5ml从侧面加入瓶内，平放轻摇40下，放置2~5分钟将PE液倒出PE液的作用：络合、吸收、去除维持组织完整性的钙、镁离子，促进细胞分离，钙、镁离子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除，将残余未倒尽的血清除尽，因为血清也会抑制胰酶的消化作用；洗去未倒尽的死细胞。
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
小鼠肾细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握小鼠肾细胞培养的方法。
2. 观察小鼠肾细胞的形态和生长特点。
3. 了解小鼠肾细胞培养过程中的注意事项。
二、实验材料1. 实验动物：8周龄健康雌性小鼠。
2. 实验试剂：不含Ca2+和Mg2+的1PBS、青霉素、链霉素、0.1%明胶、0.1%胰蛋白酶溶液、DMEM培养液、胎牛血清、成纤维细胞生长因子、庆大霉素、青霉素、链霉素、抗细胞角蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗结蛋白抗体、抗-平滑肌肌动蛋白抗体。
3. 实验器材：眼科剪、眼科镊、无菌消毒手术器械、网筛、离心管、T25培养瓶、倒置显微镜、培养箱等。
三、实验方法1. 取材：将小鼠处死后，无菌条件下迅速取出肾脏，用生理盐水冲洗干净，剥离肾被膜。
2. 切取肾皮质：将皮质组织剪成2-3mm的细条。
3. 消化处理：将肾皮质组织在100目不锈钢网筛上轻轻研磨，并用生理盐水冲洗，收集滤液。
将滤液再用150目的网筛过滤，收集网筛上富含肾小管的间质碎片。
4. 培养细胞：将收集到的间质碎片加入含有0.1%胰蛋白酶溶液的培养皿中，在37℃、5%CO2的培养箱中消化5-10分钟。
待细胞变圆后，用吸管吹打细胞，使其悬浮。
5. 制备细胞悬液：将消化后的细胞悬液用无菌离心管离心，弃去上清液，加入适量的DMEM培养液重悬细胞。
6. 细胞接种：将细胞悬液接种于T25培养瓶中，放入培养箱中培养。
7. 细胞观察：在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并拍照记录。
四、实验结果1. 细胞形态：接种后，细胞逐渐贴壁生长，呈上皮细胞样、成纤维细胞样和淋巴母细胞样等多种形态。
2. 细胞生长特点：细胞生长迅速，2-3天内即可铺满培养瓶底部。
3. 细胞鉴定：通过细胞角蛋白、角蛋白、波形蛋白、结蛋白和-平滑肌肌动蛋白等抗体检测，确认细胞为小鼠肾细胞。
五、实验讨论1. 小鼠肾细胞培养的成功率为80%左右，说明实验方法可靠。
2. 在细胞培养过程中，要注意无菌操作，避免污染。
细胞培养实验集合
实验一培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件1、温度条件（37 ＋0.5）2、pH条件（7.2-7.4）3、气体条件4、水的质量（三蒸）5、渗透压6、营养条件7、无菌条件℃二、培养基的分类1、平衡盐液2、天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸钠 .0.11 g3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000 mL四、过滤出菌电磁搅仪器：不锈钢正压滤器材料：纤维素微孔虑膜（0.22 mm 孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。
所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。
细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。
一、实验目的1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点；3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。
二、实验条件本实验在细胞工程实验室完成。
1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
动物细胞培养实验方案
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
液体配制及实验方法
液体配制及实验方法（一）液体配制1.完全培养基DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液）若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺2.PBS1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO43.胰酶用之前调节PH值至7.64.CaCl2将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性5.双抗终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml青霉素0.6μg为1个单位链霉素1.2195μg为一个单位称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml6.两性霉素B100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml7.细胞冻存液20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)8STZ溶液STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕.9油红O原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。
稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。
10茜素红称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.11成骨诱导液配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/LVitC1）β-甘油磷酸钠分子量：216 溶于水10mmol/L=216mg/100ml称取216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中2）地塞米松分子量：392.5 在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.0.1μmo l/L=0.04mg/L将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中制成25000X的浓缩液每100ml低糖完全培养基中加入4μl地塞米松浓缩液3）VitC分子量176.1 溶于水称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中12成脂诱导液配方：DMEM(L)+10%FBS+10μmol/L地塞米松+200μmol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）+10mg/L胰岛素1）每100ml高糖完全培养基中400μl地塞米松浓缩液2）吲哚美辛分子量：357.79 在无水乙醇中的溶解度为1g/50ml PH 7.4以下0.2mmol/L=7.16mg/100ml称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇制成200X的浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入500μl吲哚美辛浓缩液3）IBMX分子量：222.25 在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml)0.5mmol/L=1.1mg/100ml将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入11μlIBMX浓缩液4）Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X)每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100μl.溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
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方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。
（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。
脑和肾直接进行组织块培养。
）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。
结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。
关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法1前言初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。
学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。
细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。
当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。
了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。
结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
第三章动物细胞培养用液
⑦提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白 酶的损害。
血清的不足之处：
①存在不少有害于细胞生长和繁殖。例：补体、
免疫球蛋白和一些生长抑制因子等。
②血清的成分不明确，影响对结果的分析。
③不同动物，不同批次血清成分和活性差别比
较大，使的培养结果不稳定。
血清一般不自制，如果特殊需要需自制时要 注意： ①消毒 ②空腹 ③隔绝 ④倾斜、室温、4℃过夜 ⑤离心 ⑥滤过，血清检测
微量元素的增加较复杂，多采用商品包
装，现多培养基中已加好无需再加。
无血清培养基内必需增加酶抑制剂来中 止残余酶的作用。如，大豆胰酶抑制剂， 0.1-0.5%
九 消化液
消化液中最常用的是胰蛋白酶液和 EDTA液。
1 胰蛋白酶液
主要作用：使细胞间的蛋白质水解从而使细
胞离散。主要作用于与赖氨酸或精氨酸相连
3 贴壁因子
贴壁因子：细胞体外培养时绝大多数真核细胞
（贴壁依赖性细胞）需要固着于适当的基底， 帮助细胞固着贴附的物质叫贴壁因子或胞外
基质。
配制：
①配贮液（10×）1mg/ml,适当温度保存 ②选择适当贴壁因子保存 ③三蒸水或PBS稀释，0.1mg/ml工作液 ④滤菌 ⑤涂布 ⑥静置，洗涤
4 微量元素
①能提供细胞生存生长和增生所必需的生长调节因子。 ②能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。 ③含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养皿表面贴附和铺 展的生长基质成分。 ④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。
⑤在有些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤 害的作用。
⑥给培养液提供良好的缓冲系统。
激素：胰岛素、生长激素、胰高血糖素等、
甾体激素等。
动物实验细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本操作技术。
2. 了解细胞培养过程中可能出现的常见问题及其解决方法。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态，了解细胞生长规律。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出，在体外条件下进行培养、繁殖的过程。
细胞培养技术是生物学研究的重要手段，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学等领域。
本实验采用动物细胞培养技术，通过观察细胞在不同培养条件下的生长状态，了解细胞生长规律。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠胚胎成纤维细胞、胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、无菌培养皿、无菌移液器、细胞计数板等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、超净工作台、离心机、电子天平等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将小鼠胚胎成纤维细胞接种于无菌培养皿中，放入细胞培养箱中培养。
（2）配制DMEM培养基，加入青霉素、链霉素，混匀后过滤除菌。
2. 细胞传代（1）将培养好的细胞取出，用无菌移液器吸取适量的细胞悬液，加入无菌离心管中。
（2）以1500r/min的速度离心5分钟，弃去上清液。
（3）加入适量的DMEM培养基，混匀后用无菌移液器吸取适量的细胞悬液，接种于新的无菌培养皿中。
（4）将培养皿放入细胞培养箱中培养。
3. 细胞计数（1）用细胞计数板对细胞进行计数，计算细胞密度。
（2）根据细胞密度调整细胞传代比例。
4. 观察细胞生长状态（1）用倒置显微镜观察细胞在不同培养条件下的生长状态。
（2）记录细胞形态、细胞密度、细胞周期等指标。
五、实验结果与分析1. 细胞生长状态在适宜的培养条件下，细胞呈长梭形，排列整齐。
随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增加，细胞体积逐渐增大。
2. 细胞计数结果经过多次传代，细胞密度逐渐增加，细胞计数结果如下：第1代：1.5×10^6个/mL第2代：2.0×10^6个/mL第3代：2.5×10^6个/mL第4代：3.0×10^6个/mL3. 细胞周期分析通过观察细胞形态，发现细胞处于不同的生长阶段，包括G1期、S期、G2期和M 期。
动物医学细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和操作方法。
2. 观察动物细胞在体外培养过程中的形态变化，了解细胞生长、衰老和死亡过程。
3. 探讨细胞培养技术在动物医学研究中的应用。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出，在体外条件下进行培养和繁殖的技术。
通过细胞培养，可以研究细胞的生物学特性、细胞代谢、细胞分化等，为动物医学研究提供有力支持。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 实验器材：细胞培养瓶、超净工作台、显微镜、剪刀、镊子、培养皿、移液器、吸管、细胞培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、75%酒精、无菌生理盐水、DMSO （二甲基亚砜）3. 实验试剂：细胞培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、75%酒精、无菌生理盐水、DMSO四、实验步骤1. 取小白鼠胚胎，用剪刀剪开胚胎包膜，取出胚胎组织。
2. 将胚胎组织置于超净工作台上，用无菌生理盐水冲洗，去除杂质。
3. 将冲洗后的胚胎组织用剪刀剪成小块，加入胰蛋白酶，消化10-15分钟。
4. 倒掉消化液，加入适量细胞培养液，用吸管吹打均匀，制成细胞悬液。
5. 将细胞悬液转移至培养瓶中，加入青霉素、链霉素，防止细菌污染。
6. 将培养瓶放入细胞培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
7. 观察细胞生长情况，记录细胞形态、数量、生长速度等指标。
8. 在细胞生长过程中，定期更换培养液，以维持细胞生长环境。
9. 细胞培养至一定时期后，观察细胞衰老和死亡现象，分析衰老和死亡原因。
五、实验结果与分析1. 细胞形态：培养初期，细胞呈圆形，排列紧密。
随着培养时间的延长，细胞逐渐变长，形态不规则，出现细胞突起。
2. 细胞数量：培养初期，细胞数量增长较快，约每2-3天翻倍。
后期，细胞数量增长速度减慢，进入平台期。
3. 细胞生长速度：培养初期，细胞生长速度快，约每2-3天翻倍。
后期，细胞生长速度减慢，进入平台期。
4. 细胞衰老和死亡：培养至一定时期后，细胞出现衰老和死亡现象。
动物细胞培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 熟悉动物细胞培养过程中常用的仪器和试剂。
3. 通过动物细胞培养实验，了解细胞生长、增殖、分化的过程。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物组织或器官中的细胞取出，在体外模拟体内环境，使其在适当的营养和条件下生长、增殖、分化。
动物细胞培养是生物学、医学、药理学等领域的重要研究手段。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶。
2. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、移液器、培养皿、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，用无菌生理盐水洗涤，加入适量DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中复苏。
2. 细胞传代：将复苏后的细胞用胰蛋白酶消化，加入适量的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞观察：在显微镜下观察细胞的生长状态，记录细胞生长、增殖、分化的过程。
4. 细胞传代：待细胞铺满培养皿底部时，用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于新的培养皿中，重复上述步骤。
五、实验结果1. 细胞复苏：复苏后的细胞在显微镜下观察到细胞呈圆形，细胞质清晰，细胞核明显。
2. 细胞生长：细胞接种后，在培养箱中培养，细胞逐渐铺满培养皿底部。
细胞生长过程中，细胞体积逐渐增大，细胞核逐渐增多。
3. 细胞增殖：细胞生长过程中，细胞数量逐渐增多，细胞铺满培养皿底部的时间逐渐缩短。
4. 细胞分化：在培养过程中，部分细胞发生分化，形成不同形态的细胞。
如神经细胞、肌肉细胞等。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，温度、CO2浓度、培养基成分等条件对细胞生长、增殖、分化具有重要影响。
实验中应严格控制这些条件，以确保细胞正常生长。
2. 细胞传代过程中，应注意防止污染。
操作应在超净工作台中进行，使用无菌器材，避免细菌、真菌等微生物污染。
3. 细胞培养实验过程中，应定期观察细胞生长状态，及时调整实验条件，以保证细胞正常生长。
细胞培养实验
实验一、实验器材的清洗、包装和消毒以及实验室常用的仪器设备的使用和维护一、实验目的1、认识常用实验器材。
2、实验器材的清洗。
3、实验器材的包装和消毒。
4、了解细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。
二、实验用品1仪器压力蒸汽消毒器、电热干燥箱、超净台、自动双重纯水蒸馏器、CO2培养箱、电热恒温培养箱、真空抽气泵或电动吸引器、液氮罐、普通冰箱、超低温冰箱2试剂及耗材（1）试剂：盐酸或硫酸、洗涤用品、消毒剂等（2）耗材：培养瓶、盐水瓶、漏斗、量筒等玻璃器皿、培养皿等塑料品、解剖器械、铝饭盒、酒精灯和记号笔等用品三、实验步骤一）玻璃器械洗消：（一）新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干（二）旧的玻璃器皿的洗消：1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。
细胞培养PBS配方
细胞培养PBS配方
所需试剂和设备:
-NaCl(氯化钠)
-KCl(氯化钾)
-Na2HPO4(磷酸氢二钠)
-KH2PO4(磷酸二氢钾)
-无菌水
-电子天平
-烧杯和量筒
-反应管和磨研器
步骤:
1.称取所需试剂。
根据下述配方，称取正确比例的NaCl、KCl、
Na2HPO4和KH2PO4、确保所有试剂都是无菌的，并在称取时保持清洁卫生。
2.备制1L的PBS溶液。
将称取的试剂添加到烧杯中，并用无菌水稀
释至1L。
3.搅拌混合。
使用一个电子磨研器或类似的设备，将溶液进行彻底的
混合以确保所有试剂充分溶解。
尽可能避免气泡的形成。
4.pH调节。
使用pH计来测定溶液的pH值。
根据需要，使用NaOH或HCl溶液调节pH值。
PBS的理想pH值为7.4左右。
5.灭菌。
将溶液装入无菌试管中，并将其密封。
以121°C的温度下，在高压蒸汽灭菌器中处理溶液。
处理时间为15-20分钟。
注意事项:
-在制备PBS时务必保持实验室的环境无菌，因为这种溶液广泛应用
于细菌和真菌的生长培养中。
-要使用新鲜的试剂来制备PBS，以避免试剂的老化和变质。
-处理溶液时要小心，避免对溶液的污染。
使用无菌操作来减少污染
的风险。
-在制备PBS溶液之前，请先确保相关设备（如烧杯、磨研器等）已
经过彻底清洁和消毒处理。
动物细胞培养传代培养
实验三：动物细胞培养细胞传代培养【实验目的】熟练掌握细胞的传代培养法。
【实验原理】传代培养是组织培养常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。
【材料用品】材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks 液。
仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。
【实验步骤】1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7．倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
18．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
动物细胞培养实验
试验一：试验器材预备【试验原理】细胞培育技术与其他一般试验室工作的主要区分在于要求保持无菌操作，避开微生物及其他有害因素的影响。
一般标准的细胞培育室应包括配液室、预备室和培育室。
三室既相互连接又相对独立，各自完成培育过程中的不同操作。
【试验目的】①培育室的设置和设备。
②无菌概念和无菌操作要领。
【操作步骤】1.试验室设置（1）配液室（2）预备室（3）培育室培育室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要留意以下几点：①培育室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照耀的地方，防止室内温度增高。
②天花板的高度不要超过 2 米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流淌。
④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角积存灰尘。
2.试验室常用设备（1）预备室的设备①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。
②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。
③枯燥箱：洗涤完的玻璃器皿用枯燥箱烘干。
④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、局部液体、塑料器具等灭菌。
不同物品其有效灭菌压力和时间不同。
⑤储品柜 1：放置未消毒物品。
⑥储品柜 2：放置已消毒物品。
预备室留意事项：①预防蒸馏器被烤干。
②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。
④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。
（2）配液室的设备①天平〔扭力天平和电子天平〕：称量用②pH计。
③磁力搅拌器。
（3）细胞培育室的设备①超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，缓缓通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。
依据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，根本原理大致一样，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的干净气流从确定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高干净度工作环境。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
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动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
动物细胞悬液的制备
动物细胞悬液的制备
动物细胞悬液的制备：关键步骤与注意事项
动物细胞悬液的制备是生物学实验中的常见操作，尤其在细胞培养、流式细胞术、细胞分选等领域有着广泛的应用。
下面将详细介绍动物细胞悬液制备的关键步骤及注意事项。
首先，选择合适的细胞培养基是至关重要的。
培养基应提供细胞所需的营养成分，如氨基酸、维生素、矿物质等，并维持适当的pH值和渗透压。
同时，确保培养基无细菌、支原体等污染。
其次，细胞消化是制备细胞悬液的关键步骤。
通常使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液进行细胞消化。
在消化过程中，要密切关注细胞形态变化，避免过度消化导致细胞损伤。
在制备细胞悬液时，还需注意细胞密度的调整。
细胞密度过高可能导致细胞缺氧、生长受限，而细胞密度过低则可能影响实验结果的准确性。
因此，应根据实验需求调整细胞密度。
此外，离心和洗涤步骤也是制备细胞悬液过程中不可忽视的环节。
离心可以去除培养基中的杂质和未贴壁的细胞，洗涤则可以进一步纯化细胞悬液。
在离心和洗涤过程中，要选择合适的离心速度和时间，并避免过度离心导致细胞损伤。
最后，在制备细胞悬液过程中，应严格遵守无菌操作规范，避免细胞污染。
同时，实验人员应具备扎实的细胞培养知识和技能，以确保实验结果的准确性和可靠性。
总之，动物细胞悬液的制备涉及多个关键步骤和注意事项。
通过掌握细胞培养基的选择、细胞消化、细胞密度调整、离心和洗涤等关键技术，并严格遵守无菌操作规范，可以成功制备出高质量的动物细胞悬液，为后续的生物学实验提供有力支持。
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实验三动物细胞培养用液配制
一、实验目的
1.了解细胞培养常用培养液和试剂配制的基本方法。
2.初步掌握高压灭菌和抽滤灭菌的方法。
.
二、器材与试剂：
RPMI-1640干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.蒸馏水、电子天平、PH计、磁力搅拌器、5.6%的NaHCO
3
三、实验原理
动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。
配制这些常用液有严格的要求：
(1)使用高纯化的三蒸水。
(2)按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。
(3)保证各组分完全溶解。
(4)进行pH值测试和调整。
(5)消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。
四、具体步骤：
1、酚红（0.1%）
配法：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO
3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO
3
溶液使最终体
积为100mL，瓶装保存，备用。
2、Hanks平衡盐溶液。
（Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
）
1.按表称取Hanks、D-Hanks试剂。
表13-2 D-Hanks试剂的配制
成份Hanks D-Hanks
CaCl20.140 －
KCl 0.400 0.400
KH2PO40.060 －
MgCl2·6H2O 0.100 －
MgSO4·7H2O 0.100 －
NaCl 8.000 8.000
NaHCO30.350 0.350
Na2HPO4·12H2O －0.132
Na2HPO4·7H2O 0.090 －
D-葡萄糖 1.000 1.000
酚红（0.1%）1mL 1mL
2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。
3.高压灭菌，10磅10min。
注意事项
1.BSS的pH值应确定为7.2左右。
与含有其他成分的液
2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaCl
2
体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。
这样可以避免高压灭菌后液体变混。
3、细胞消化液：0.25％胰蛋白酶液
1.称取0.25g胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL
2.滤过除菌，调pH值7.4，-20℃冻存。
4、10000单位／ml硫酸链霉素、青霉素G钾盐的配制
硫酸链霉素 1g
青霉素G钾盐 100万单位
将上述两种药品溶于100mL生理盐水中，然后灭菌（过0.45μm的滤膜），分装于青瓶中放－20℃保存。
使用时可按100单位／mL稀释。
5、胎牛血清
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。
1.将血清加热至56℃并保持30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2.处理后的血清贮存于4℃。
6、RPMI 1640培养液（基本培养基）
① 配1升RPMI1640培养液的粉末(1袋)+2gNaHCO
3。
② 溶于800mL蒸馏水中充分搅匀。
③ 用HCl调节PH7.2-7.4。
④ 用蒸馏水补足1L。
⑤ 用灭过菌的滤器过滤（用φ0.45或0.20μm滤膜）。
⑥用灭过菌的瓶分装（学生实验）100ml/瓶。
RPMI 1640完全培养基按如下比例配制：基本培养基占90%，小牛血清占10%。
按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
五、思考题
1.任何保证胰蛋白酶的活性
2.Hanks与D-Hanks的区别。