溶菌酶检验标准

1术语和定义

溶菌酶酶活性单位：在25℃、pH值为6.2的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量为一个酶活性单位U。本定义适合“比浊法”。

溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为u。本定义适合“管碟法”。

2技术要求

2.1外观和性状要求

粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。

2.2技术指标

4.2.1粉酶水分含量：≤12%。

4.2.2粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。

4.2.3粉酶炽灼残渣：≤10.0%。

4.2.4酶活（效价）指标

4.2.5卫生指标

符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。

3试验方法

本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。

3.1外观的测定

取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。

3.2粉酶水分的测定

按GB/T 6435 规定进行检测。

3.3粉酶粒度的测定

按GB/T 5917 规定进行检测。

3.4粉酶炽灼残渣的测定

按《中国兽药典》规定进行检测。

3.5卫生指标的测定

按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。

3.6溶菌酶酶活性（效价）的测定

溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下，通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用，计算出溶菌酶活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法）。

3.6.1试剂和溶液

5.6.1.1溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus）

将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。

使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间，最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。

5.6.1.2磷酸缓冲液

称取磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）11.7g, 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）7.86g，加900mL水溶解,调pH 值至6.2，定容至1000mL。

5.6.1.310％氢氧化钠溶液

5.6.1.41％硫酸铜溶液

5.6.1.530%三氯醋酸

5.6.1.6斜面培养基：营养琼脂

5.6.1.7抗生素检定培养基II号

5.6.1.8溶菌酶标准品

3.6.2仪器

5.6.2.1分析天平：精密度0.1m g；

5.6.2.2牛津杯：牛津杯内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高10.0±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致；

5.6.2.3陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌；

5.6.2.4游标卡尺：精度0.02mm；

5.6.2.5双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡；

5.6.2.6超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备；

5.6.2.7pH酸度计：精确到0.01；

5.6.2.8分光光度计：配10mm比色皿，可在450nm下测定吸光值；

5.6.2.9离心机：转速为4000r/min以上；

5.6.2.10秒表：每小时误差不超过5s；

5.6.2.11恒温培养箱：设置漂移温度为35℃～37℃；

5.6.2.12高压灭菌锅

5.6.2.13烘箱

5.6.2.14其它玻璃器皿：刻度吸管: 1 mL，2mL，5mL，10mL，25mL无菌吸管等；

3.6.3试验方法

5.6.3.1鉴别

固体样品：取本品10mg，溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，产生白色沉淀。

取试管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴，混匀后，应显紫玫瑰色。

5.6.3.2方法一：比浊法

特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在450nm条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活力。

①试验步骤：

精确称取样品（液体样品需在离心机上以3500r/min离心10min后取上清液）不少于20mg，用pH6.2

的0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位为100U/ mL ~200U/mL，备用。

将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用生理盐水从培养基上洗脱下来，并稀释到一定倍数，使其在25℃时，在450nm波长处测定的吸光度A0为0.65～0.75之间。

精密取底物悬浮液2.5mL，放入比色杯中，在450nm波长处测定其吸光度，作为零时读数，然后取样品溶液0.5mL，加入比色杯中，用秒表开始计时，迅速混合，以磷酸缓冲液做空白，到60秒时记下吸光度A60、。

②试样酶活力的计算：

1000

X D = × (A0-A60) × N × 2 ————————（1）

M

式（1

N —样品总的稀释倍数

5.6.3.3 方法二：管碟法

利用溶菌酶的抗菌性质及其溶液在琼脂培养基内的扩散作用，将未知效价的样品液与已知效价的标准溶液，在同一条件下，在摊布高度敏感性特定试验菌的培养基上进行一定时间的对照培养，溶菌酶溶液在培养基内的扩散到达适当范围内时就产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈，并且在一定的溶菌酶浓度范围内，溶菌酶对数浓度与抑菌圈直径成正比。经比较标准液与样品两者抑菌圈直径或面积大小，采用二剂量法，即可推算出样品的效价。