光合细菌分离及培养条件研究报告

光合细菌M-01的分离及培养条件研究

[摘要]从湛江市霞山区海滩表层污泥中富集分离出红假单胞菌属光合细菌M-01,对其培养条件进行了初

步探讨,结果表明:菌株生长温度为30e时,最适培养光照度为3 000 lx。培养基正交实验结果表明其最优

培养基配方为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾0.2 g,乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,氯化钠1 g,酵母膏0.15 g,硫酸镁

0.2 g,T.M储液少量,蒸馏水1 000 mL。其中乙酸钠为最大影响因子。

[关键词]光合细菌(PSB>。分离。培养。正交实验

光合细菌(Photosynthetic bacteria>是一类光合自养型古老细菌,具有较强的分解有机物特性,光合

细菌作为水质净化剂广泛应用于水产动物如一些经济鱼类、虾蟹、贝类的养殖和育苗中[1~4]。在生产上有

意义的红螺菌科包括红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属[4]。现已有学者对红假单胞菌的分离、鉴定、培

养特性及保藏做了研究[5~7],但还没有关于其营养条件优化的报道。笔者从海洋环境中分离到了光合细

菌M-01,采用正交实验方法进行了培养条件优化的研究。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

(1>待分离材料取广东省湛江市霞山区海滩表层污泥。

(2>培养基使用红螺菌科富集培养基作为富集分离基础培养基[8]。

1.2 方法

(1>菌株的分离筛选方法取污泥10 g,装入500 mL细口无色玻璃瓶中,加入富集培养液至满,盖上

瓶盖,隔绝空气,于30e, 3 000 lx光照下进行富集培养3~4 d,培养液呈绛红色后,取富集培养菌液1

mL,转接入培养液中,重复以上操作2次,然后采用改良的Hungate厌氧培养技术>>>柱滚管法[9]进行

分离纯化,用分离培养基的琼脂柱穿刺培养后保存。

(2>细胞色素光谱吸收峰值测定方法培养物离心后洗涤,将细胞悬浮于60%的蔗糖溶液中,采用

722S分光光度计扫描,波长范围为340~1 000 nm。

(3>生长量的测定为比较不同培养条件下(光照、接种量、营养条件>培养物生长量的差别,采用

722S分光光度计检测培养物D660 nm值。

(4>光照度对菌株生长影响的测定将已接种的光合细菌培养液于温度30e,光照度分别为 2 000、

3 000、

4 000、

5 000、

6 000 lx下培养3 d,每组3管,用722S分光光度计测定培养物菌液光密度D660 nm(用

培养初刚接种的培养液为空白对照>。

(5>酵母膏添加量对菌株生长影响的测定在培养液中分别加入酵母膏,令其质量分数分别为0100、

0105、0110、0115、0120、0125、0130 g/L。

(6>培养基正交实验根据预备实验,设计5因子4水平的正交实验(表1>,在温度30e,3 000 lx光

照条件下进行培养基的正交实验。

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长江大学学报(自科版>2005年8月第2卷第8期/农学卷第25卷第3期

Journal of YangtzeUniversity(Nat Sci Edit>Aug. 2005 Vol12 No18 /Agri Sci V, Vol125 No13表1 培养基正交实验因素水平

Table1 Factor levels of orthogonal experiment

of the culture mediag/L

水平A

氯化铵

B

磷酸氢二钾

C

乙酸钠

D

碳酸氢钠

E

酵母膏

1 015 011 210 015 0105

2 110 012 310 110 0110

3 115 013 410 115 0115

4 210 014 510 210 0120

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征及培养特征

共分离纯化菌株5株,记为M-01、M-02、M-

03、M-04、M-05,均为棕红色菌落,培养特征类

似,M-01株生长速度较快,以其做以下实验。

菌株M-01幼龄呈短杆状,不形成丝状体,细

胞大小(016~019>Lm@(112~210>Lm。芽生

分裂,分裂时产生哑铃状的菌体。鞭毛染色,可见

极生鞭毛。

在光照厌氧液体培养中繁殖速度快,培养液

起初呈浑浊状,淡黄色,后来逐渐出现絮状物,转变为浅红色,最后呈深红色。在琼脂平板上菌落呈圆形,

边缘整齐,表面凸起,光滑湿润,棕红色。

2.2 菌株的最大吸收波长

图1为光合细菌活细胞的吸收光谱。由图1可见,活细胞的吸收峰位于380、500、535、590、805、860

nm等处,最大吸收波长为380 nm。光合细菌在380、805、860 nm处具有吸收,表明光合细菌

含有细菌叶

绿素a,在500、590、535 nm处具有吸收,表明光合细菌的活细胞中还含有类胡萝卜素[10]。活细胞吸收峰

值表明M-01具有光合细菌典型吸收特征。

图1 光合细菌活细胞吸收光谱

Figure1 The optical density of M-01living cells

2.3 菌株的鉴定

根据上述实验结果,又依据红假单胞菌属Rhodopseudomonas的形态、生理生化特征[10],初步确认菌株

M-01为红假单胞菌属Rhodopseudomonas中的一种。

2.4 光照度对菌株生长的影响

图2为不同光照条件下光合细菌M-01的光密度。由图2可见,在温度30e,3 000~5 000 lx 时,该

光合细菌均保持旺盛的生长势头,在实验培养中发现,4 000~5 000 lx光照条件下生长迅速,菌液迅速转

红,但是细胞老化较快,易出现破碎细胞附壁现象,因而认为3 000 lx是该光合细菌的适宜光照度。

2.5 培养基中酵母膏添加量对其生长的影响

图3为不同酵母膏添加量时光合细菌M-01培养48 h的光密度。由图3可见,添加酵母膏对菌株生

长有明显的促进作用,但是当酵母膏添加量为011 ~ 013 g/L时,光合细菌培养48 h时菌液光密度值差

别不大,由于酵母膏同时有促进其它菌类生长的作用,为减少杂菌污染的机会,结合生产中降低成本的要

求,笔者认为酵母膏添加量为0110 ~ 0115 g/L是合适的。

#73#农学卷第25卷第3期操玉涛等:光合细菌M-01的分离及培养条件研究图2 光合细菌M-01在不同光照度下的光密度

Figure2 The optical density of the

photosynthetic bacteria M-01

图3 不同酵母膏添加量时M-01培养48 h的光密度

Figure3 The optical density of48h M-01liquid

with different yeast paste contents

表2 正交实验结果

Table2 The results of orthogonal experiment

编号

各因素水平

氯化铵

A

磷酸氢二钾

B

乙酸钠

C

碳酸氢钠

D