生化制备技术实验操作指导
动物医学 生化实验《实验五 动物组织中DNA的制备》课件
柠檬酸盐，EDห้องสมุดไป่ตู้A等螯合剂 除DNase 所需 Mg2＋，降低该酶活性。
【 试剂 】 1．NaCl–柠檬酸钠 。 2. NaCl– EDTANa2 。 3．5% SDS 。 4．氯仿–异戊醇溶液 。 5．0.01mol/LNaOH 。 6．95％乙醇 。
实验五 动物组织中DNA的制备
【原理】 将肝脏组织细胞破碎提取细胞核中DNA。 脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白在不同盐溶液
中具不同的溶解度。在0.15mol/L NaCl的稀盐 溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋 白的溶解度则最小 。在1mol/L NaCl的浓盐溶 液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，核糖核蛋 白的溶解度则明显降低。
【器材】 1．玻璃匀浆器。 2 ．离心机 。 3 ．30ml离心管。 4 ．加样枪。
【材料】 肝脏
【操作】 1.取1g肝，置入玻璃匀浆器，加入2ml
0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液， 匀浆，使细胞充分破碎，再加该溶液至5ml。 2 .转移至5ml离心管中，6 000r/min离心 15min。弃上清，沉淀中加入4倍体积 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液 搅匀， 6 000r/min离心15min ，弃上清， 留沉淀。
3.将沉淀中加入5倍体积0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2 溶液，搅 拌溶解。边搅边滴加5%SDS溶液，至 SDS的终浓度达1%为止。此时溶液变 粘稠。加5mol/L NaCl使终浓度达 1mol/L，溶液由稠变稀。
4 .将溶液转入30ml塑料离心管中，加入等 体积的氯仿–异戊醇溶液振荡混匀，静止 10min。3 000r/min离心10min 。
生化试剂开发流程和指导原则
生化试剂开发流程和指导原则全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：生化试剂是生物医药领域中不可或缺的重要工具，用于诊断、治疗以及疾病研究。
生化试剂的开发包括从前期研发到产品上市的全过程，需要经历多个环节和步骤。
而在这个过程中，合理的指导原则和流程是非常关键的。
本文将从生化试剂开发的流程和指导原则方面进行探讨和总结。
一、生化试剂开发流程1. 研究背景分析：在开发生化试剂之前，需要进行充分的研究背景分析，明确试剂的应用领域、市场需求以及竞争对手情况。
只有了解市场需求和竞争情况，才能确定开发的方向和策略。
2. 试剂设计：根据研究背景和市场需求，确定试剂的种类、规格、用途等，进行试剂的设计。
设计阶段需要考虑试剂的稳定性、灵敏度、特异性等特性，确保试剂的质量和性能。
3. 试剂制备：在试剂设计确定后，进行试剂的制备。
通过严格的实验操作和质量控制，确保试剂的制备过程符合标准要求，保证试剂的质量。
4. 试剂验证：制备完成的试剂需要进行验证，确保试剂的性能符合设计要求。
验证包括对试剂的特异性、灵敏度、稳定性等进行测试，验证结果要符合相关标准。
5. 临床试验：通过临床试验验证试剂在临床应用中的效果和安全性。
临床试验是生化试剂开发的重要环节，需要遵循伦理规范和法律法规，确保试剂的安全性和有效性。
6. 注册和上市：经过临床试验验证合格后，进行试剂的注册和上市。
注册包括提交申请资料、审批、监管等流程，上市后需要进行市场推广和销售。
1. 合理规划：在生化试剂开发过程中，需要合理规划每个环节和步骤，确保流程顺利进行。
制定详细的开发计划和时间表，及时调整和优化方案。
2. 质量控制：生化试剂的质量是试剂开发的核心要素，必须进行严格的质量控制。
对于每个环节和步骤都要进行质量监控，确保试剂的质量和性能符合要求。
3. 创新思维：在生化试剂开发中，需要有创新的思维和能力，不断探索和尝试新的方法和技术。
只有不断创新，才能走在行业的前沿，取得竞争优势。
微生物生化和血清学试验标准操作规程
触酶试验标准操作规程1.目的规范触酶试验标准操作规程。
2．原理具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。
3．试剂3％过氧化氢溶液。
4．质控金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性，肺炎链球菌ATCC 4961 9阴性。
5．操作步骤取3％过氧化氢溶液0．5 ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1～3 ml滴加入盐水菌悬液中。
6．结果判断培养物出现气泡者为阳性。
7．注意事项7．1细菌要求新鲜。
7．2不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。
7．3需用已知阳性菌和阴性菌作对照。
8．临床意义在革兰阳性球菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌及微球菌均阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。
氧化酶试验标准操作规程1．目的l规范氧化酶试验标准操作规程。
{2.原理氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
3 . 试剂盐酸二甲基对苯二胺(或四甲基对苯二胺)0.1g，加蒸锱水10ml，置于棕色瓶内可用一周。
冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。
4. 质控铜绿假单胞菌ATCC27853阳性，大肠埃希菌ATcc 25922阴性。
5.操作步骤去洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加1滴10g／L盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。
6．结果判断立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性。
7. 注意事项7．1 试剂在空气中易氧化，故应经常更换新试剂，或配置时试剂内加入0．1％维生素c以减少自身氧化。
7. 2 不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落(葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性)。
7．3实验时应避开含铁的培养基等含铁物质，因本实验过程中，遇铁时会出现假阳性。
8 . 临床意义8. 1 用于奈瑟菌属﹑非发酵等细菌的鉴定。
如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化8．2所有的革兰阴性菌均应进行氧化酶试验，如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化酶阳性的嗜水气单胞菌错误地鉴定为大肠埃希杆菌或沙雷菌。
酪蛋白的制备----生化实验
一、目的
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜牛奶
（一）试剂
1、95%乙醇1 200mL
2、无水乙醚1 200mL
3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml
先配A液与B液
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。
将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
（二）酪蛋白的纯化
1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。
2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。
（三）准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。
五、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。
生物化学实验指导1
生化实验室的一般规则1. 进入实验室应穿着工作服。
留长发的同学应挽短、戴帽。
2. 整洁。
实验台必须洁净，各种仪器放置要有秩序。
实验完毕，必须将仪器洗净、放好，拭净台面，方可离开实验室。
3. 安静。
实验时不可谈笑，如有问题可以小声请教师解答。
4. 废物及废液处理。
实验完的废液应倾入水槽中，并用水冲净。
但浓酸、浓碱及氰化物等不可倒入水槽，应倾入预先准备的废液盆或污物桶中。
少量浓酸、浓碱可直接倾入水槽，然后以大量流水冲净。
火柴梗、废滤纸、棉花等不可扔入水槽，应弃入废物盆或垃圾箱中，以免堵塞水管。
5. 试剂与标准溶液。
取用试剂后，应立即将瓶塞盖好；放回原处。
取用有毒试剂时，须用滴定管或滴管。
取样时，应注意用多少取多少。
如未用完只可弃去，不可倒回瓶中；6. 凡可产生烟雾或有毒气体的实验必须在通风橱中操作。
7. 在用恒温水浴箱保温时，应注意随时盖好箱盖。
调节温度到所需温度后，即不再旋动调温旋扭。
8. 贵重仪器如分光光度计、离心机等必须爱护，使用前应熟读使用方法，记住操作要点，按操作规程工作。
如有问题应请教师帮助，不得自行拆卸检修。
9. 防火。
勿使酒精、乙醚或其它易燃试剂靠近火焰。
若蒸发此类溶液时，应用水浴，不得直火加热，以免发生火灾。
10. 实验前应熟读实验指导，记住要点。
实验时应仔细操作并注意观察现象及结果，及时记录。
生化实验的基本操作-1-一、玻璃器皿的洗涤玻璃器皿的洗涤在生物化学实验中是一项重要的工作。
实验性质不同所采取的洗涤方法也不同。
例如研究酶制备的反应时，组织匀浆对金属的污染是非常敏感的，至于细菌的悬浮液对少量的金属可能不敏感，但少量的维生素和其它有机物质则有较大的影响。
一般氧化剂洗液如重铬酸洗液不能有效地除去油脂、硫酸钡等污迹。
因此污迹不同所应采用的洗涤试剂和方法也不同。
如可用汽油或洗涤剂（洗衣粉液或洗洁净）除去油脂，用酸性硫代硫酸钠溶液或热草酸除去氧化性污迹MnO2等，用40％尿素除去附着管内壁的血凝块等。
生化与分子生物学实验指导
⽣化与分⼦⽣物学实验指导⽣化与分⼦⽣物学实验指导-（)————————————————————————————————作者:————————————————————————————————⽇期:实验⼀氨基酸纸层析法⼀、实验⽬的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作⽅法。
⼆、实验原理纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是⽣物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常⽤技术,可⽤于蛋⽩质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法⼜称纸⾊谱法,是⽤滤纸为⽀持物,所⽤展层溶剂⼤多由⽔和有机溶剂组成,滤纸纤维与⽔的亲和⼒强,与有机溶剂的亲和⼒弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的⽔分是固定相,有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的,称上⾏法；由上向下移动的,称下⾏法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点),进⾏展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进⾏分配。
由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率⽤Rf 值表⽰：在⼀定条件下某种物质的Ｒf 值是常数。
Ｒf 值的⼤⼩与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只⽤⼀种溶剂展层,就不能将它们分开。
为此，当⽤⼀种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再⽤另⼀溶剂展层,从⽽达到分离⽬的,这种⽅法称为双向纸层析法。
氨基酸⽆⾊,可利⽤茚三酮显⾊反应,将氨基酸层析点显⾊作定性、定量⽤。
所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产⽣蓝紫⾊物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产⽣(亮)黄⾊物质。
三、药品器材1器材层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪⼑、层析缸、⽑细管、电吹风、刻度尺、铅笔。
R ｆ=原点到层析斑点中⼼的距离原点到溶剂前沿的距离2试剂(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。
生化技术实验指导
实验一 DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖一、实验目的掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；精密pH试纸。
2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂四、操作步骤1．制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
生化实验室作业指导书
生化实验室作业指导书
1. 实验目的，指导书会明确列出每个实验的目的，即该实验的重点是什么，学生需要通过实验达到什么样的学习目标。
2. 实验原理，指导书会详细介绍实验涉及的生化原理和相关背景知识，以便学生能够理解实验的理论基础。
3. 实验步骤，具体的操作步骤是指导书中非常重要的一部分，会详细描述每个实验的步骤和操作方法，以及所需的实验器材和试剂。
4. 安全注意事项，在进行生化实验时，安全是非常重要的，指导书会列出实验室的安全规定和注意事项，包括化学品的使用、实验器材的操作注意事项等。
5. 数据记录与分析，指导书通常会要求学生记录实验过程中的数据，以及进行数据分析和实验结果的总结与讨论。
6. 实验报告要求，最后，指导书通常会明确要求学生完成实验报告的格式和内容要求，包括实验目的、原理、步骤、结果分析等
内容。
生化实验室作业指导书的编写需要考虑到学生的实际水平和实
验条件，以及实验的教学目标和要求。
指导书的内容应该清晰明了，能够帮助学生顺利完成实验并达到预期的学习效果。
同时，指导书
也应该注重培养学生的实验操作能力、数据处理能力和实验报告撰
写能力。
希望这些内容能够帮助你更好地理解生化实验室作业指导
书的内容和要求。
生物化学实验的基本操作
一、玻璃仪器的使用及清洁（一）玻璃仪器的洗涤及干燥1、一般仪器：烧杯、试管、离心管等普通玻璃仪器，可直接用毛刷蘸餐洗净刷洗，然后用自来水冲洗，直至容器内不挂水珠即可。
最后用少量蒸馏水冲洗内壁2－3次，倒置晾干即可。
2、容量分析仪器：容量瓶、滴定管及吸管等容量仪器，用后用自来水多次冲洗，如能清洁（壁不挂水珠），再用蒸馏水少量冲洗2~3次晾干即可备用。
若仍不干净附有油污等，则须于干后放入铬酸洗液内浸泡数小时，然后倒净（或捞出）洗液，用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次晾干备用。
在做酶学实验时，对仪器的清洁要求更高，因如有极微量的污物（如重金属离子）即可导致整个实验失败。
因此，必要时仪器经上述方法洗涤后，还需用稀盐酸或稀硝酸洗涤，以除去铬及其它金属离子，然后再用自来水、蒸馏水冲洗。
生化实验室常用的洗液有以下几种：（1）铬酸洗液：为最常用的洗液，由重铬酸钾、粗硫酸及水配制而成，去污力强，清洗效果好。
其配制方法有多种，可根据需要进行选择，常用的配方如下表。
重铬酸钾（ｇ）100 60 100水（ｍｌ）750 300 200粗硫酸（ｍｌ）250 460 800清洁性能较弱较强（常用）最强配制方法为：先将重铬酸钾溶于水，再慢慢加入浓硫酸。
因配制过程产生大量热，容器需放入冷水中，边加硫酸边搅动混合。
由于产热量很大，使用玻璃容器有破裂的危险，所以最好用耐高温的陶瓷或耐酸的搪瓷容器。
洗液可多次反复使用，如效力变弱，可加入少量重铬酸钾及浓硫酸继续使用，但如果变为绿色，则不宜再用。
（2）10%尿素液：为蛋白质良好溶剂，帮适用于洗涤盛血的容器。
（3）草酸盐液：用于清洗过锰酸钾的痕迹。
（4）硝酸液：用1：1的硝酸水溶液，用于清洗CO2测定器及微量滴定管。
（5）乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Nａ2）液：5~10%的EDTA－Nａ2液可用于洗涤器皿内无机盐类。
玻璃仪器的干燥方法可根据不同仪器的种类而定。
生化实验基本操作要求
实验数据的记录：准确、完整、清晰、及时
数据处理结果：确保数据的准确性和可靠性
数据处理报告：撰写数据处理报告包括数据处理方法、结果、结论等
数据处理：使用专业软件进行数据处理和分析
实验结果分析和报告撰写
PRT FIVE
实验结果的分析方法
结果比较：将实验结果与预期结果进行比较分析差异原因
审阅结果：通过、修改后通过、不通过等
评价标准：科学性、准确性、完整性、创新性等
实验质量的保证和提高
PRT SIX
实验误差的分析和控制
实验误差的来源：仪比实验等方式进行评估
实验误差的控制：选择高精度仪器、规范操作流程、控制实验环境等
实验误差的修正：通过统计方法进行修正如线性回归、最小二乘法等
实验器材的准备和使用
实验器材的种类：包括试管、烧杯、滴定管、离心管等
实验器材的规格：根据实验需求选择合适的规格
实验器材的清洁：使用前应进行清洁和消毒
实验器材的使用：按照操作规程正确使用实验器材避免损坏和污染
试剂的配制和储存
试剂配制：按照实验要求准确称量、溶解、混合等步骤
试剂储存：根据试剂性质选择合适的储存条件如温度、湿度、避光等
结论总结：根据实验结果和比较分析得出结论并撰写报告
观察实验现象：记录实验过程中的现象和变化
数据处理：对实验数据进行整理、分析和解释
实验报告的撰写规范和要求
实验目的：明确实验的目的和意义
格式要求：按照规定的格式要求撰写实验报告包括字体、字号、页边距等
参考文献：列出参考的文献和资料包括书籍、期刊、网络资源等
实验环境控制：保持实验室清洁避免污染确保实验设备正常运行
实验操作步骤和要点
生化实验指导
实验一缓冲溶液的配制和氨基酸两性性质测定一、目的要求1．了解缓冲溶液的作用原理及缓冲原理，学习缓冲溶液的设计、配制及酸度计的使用方法。
2．观察甘氨酸的两性性质和缓冲作用。
二、实验原理能抵抗一定量酸或碱的影响，而保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。
缓冲液一般是由弱酸或弱碱与它的盐组成。
如乙酸和乙酸钠组成乙酸缓冲液、硼酸和硼砂组成硼酸缓冲液等。
缓冲液可分为一般缓冲液(或通用缓冲液)和标准缓冲液两类。
标准缓冲液pH值是一定的(与温度有关)，叫做pH标准液，当用酸度计测量溶液的pH值时，就要用pH标准液来校正仪器。
一般缓冲液的pH值可用下式计算：式中的Ca、Cb、Cs分别为弱酸、弱碱、盐的浓度(mol/L)；Ka、Kb分别为弱酸、弱碱的电离常数；Kw为水的离子积。
当温度一定时，pKa(或pKb)为一常数，因此缓冲液pH值就随着盐和酸(或碱)的浓度比值而变化。
如果制备缓冲液时所用的盐和酸的浓度相同，则配制时所取盐和酸的溶液的体积比就等于它们的浓度比，故上式可写为：可见只要按盐和酸溶液的毫升数的不同比值配制就可得到不同pH值的缓冲液。
如加水稀释，其盐和酸的浓度都以相同比例降低，比值不变，因此适量稀释不影响缓冲液的pH值。
缓冲液能抵抗一定量酸或碱的作用称缓冲作用，缓冲作用的大小称为缓冲能力或缓冲容量(β)，可定义为每升缓冲液改变一单位pH值所需加入强碱或强酸的量(摩尔数)。
一种特殊的酸和它相配对的碱在它们浓度相等(即pH值等于酸的pKa)时，缓冲能力最大。
缓冲能力除与其共轭酸碱对的比率有关外，还与总浓度有关，总浓度越大，缓冲能力越强，一般缓冲液浓度在0.05～0.20mol/L，pH=pKa±1的范围内具有满意的缓冲能力。
α－氨基酸是一类两性物质；既可以和酸作用，又可以和碱作用，对酸、碱的加入具有一定的缓冲能力；通过甘氨酸的酸、碱滴定及测量不同浓度的酸、碱条件下甘氨酸溶液的pH值，绘出—条滴定曲线，从中可以看到这种变化。
生化实验 (2) - 好
实验五、维生素C的定量测定（碘量法）一、目的：掌握测定维生素C含量的方法二、原理：利用碘酸钾作氧化剂，即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾-淀粉指示剂，用已知的浓度的碘酸钾滴定，滴入的碘酸钾释放出游离的碘，此碘液被维生素C还原，直到VC 完全氧化后，再滴入碘酸钾（KIO3）时，因无VC的作用，游离的碘可使淀粉指示剂呈蓝色。
即为终点。
反应如下：KIO3+5KI+6HCI→6KCI+3H2O+3I2C 6H8O6＋I2= C6H6O6＋2HI抗坏血酸脱氢抗坏血酸三、材料：梨、苹果、桔子四、试剂、仪器滴定架+滴定管+沙网移液管（1ml） 2个（5ml） 2个三角瓶 1个容量瓶（25ml） 1个吸耳球 1个研钵 1套试剂如下：① 2%盐酸：取36.6%的盐酸110ml 加入到蒸馏水中，定容至2000ml即公式：36.6%·X=2%·Y，Y设定为1000或2000ml② 0.5%淀粉液：称取5克可溶性淀粉，先用水将淀粉调至浆状，后加水至1000ml 煮沸，或用煮沸的蒸馏水配制。
② 0.000167 mol/L 碘酸钾溶液：精确称取碘酸钾0.3568克，定容至1000ml,得到0.00167mol/L 碘酸钾溶液，再稀释10倍，得到0.000167mol/L 碘酸钾溶液。
（100ml 母液+蒸馏水至1000ml ） ④ 1%碘化钾，1克碘化钾+蒸馏水至100ml 五、方法与步骤 1、样品液制备①样品洗净，拭干水分，去皮、去核。
②称取5克放入研钵中，加入2%HCI 2ml ，研磨至浆状，用沙网过滤③移入容量瓶中，用2% 盐酸冲洗2～3次，后并入容量瓶中，用2%盐酸定容至25ml,摇匀，放置半小时（暗处） 2、滴定①在三角瓶中，用移液管注入1% KI 液 0.5ml 1% KI 液 0.5ml 0.5%淀粉液 1 ml 另空白对照试验 0.5%淀粉液 1 ml 样品提取液 5ml （共10ml ） 2%盐酸 5ml 蒸馏水 3.5ml 蒸馏水 3.5ml用0.000167mol/L 碘酸钾滴定，要一滴滴加入，并时时摇动三角瓶，至微兰色不褪为终点（1分钟不褪即可），记录所用碘酸钾毫升数。
生化实验操作规程
生化实验操作规程一、实验目的本实验操作规程旨在确保生化实验的顺利进行，保证实验结果的准确性和可重复性。
二、实验前准备1. 确认所需实验器材和试剂的齐全性。
2. 检查实验室安全设备的完好性，如洗眼器、紧急淋浴等。
3. 穿戴实验室安全防护用具，如实验服、手套、眼镜等。
4. 清洁并消毒实验台面和各项实验器皿。
三、实验操作步骤1. 根据实验需求，准备好所需样本和试剂，并按照提供的配方准确称量。
2. 将准备好的样本和试剂按照实验器具要求加入相应容器中，并进行混匀。
3. 设置实验仪器或设备的参数，确保其正常运行。
4. 将准备好的样本和试剂按照实验要求进行处理，如加热、冷却、离心等。
5. 在实验过程中，保持实验操作区域的整洁，避免交叉污染。
6. 在实验操作完成后，根据实验要求及时保存或处理样本和试剂。
7. 清洁并消毒使用过的实验器具，确保下次使用前的准备工作。
四、实验安全注意事项1. 遵守实验室安全操作规范，严禁单独操作以及无指导下进行实验。
2. 注意个人防护，正确佩戴实验服、手套、眼镜等防护用具。
3. 使用化学试剂时，避免直接接触皮肤和吸入有害气体。
4. 注意实验仪器或设备的安全操作要求，避免损坏设备或引发事故。
5. 在实验过程中，及时清理溢出物和废弃物，并正确处理。
五、实验记录与结果分析1. 按照实验要求记录实验操作的步骤、试剂使用量等相关信息。
2. 将实验结果进行详细记录，并进行数据分析和解释。
3. 对实验结果进行总结，归纳出可能存在的误差和改进方向。
六、实验后处理1. 根据实验室规定，妥善处理产生的废弃物和实验材料。
2. 清洁实验器具并归位，确保实验室的整洁和安全。
七、实验注意事项1. 严格按照操作规程进行实验，不得随意更改实验过程或参数。
2. 在实验过程中严禁食品和饮品的摄入，以免引起误食或误呼吸。
3. 如在实验过程中遇到问题或意外情况，应立即向指导老师报告。
通过以上的实验操作规程，我们能够确保每一次生化实验的顺利进行，并获得准确可靠的实验结果。
八种常用生化实验步骤资料
实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
生化实验基本操作
• 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1-2%稀盐酸 溶液中浸泡2-6小时，除去附着的游离碱，再 用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2-3次。
总的原则：凡用过的玻璃仪器，均应立即洗 涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗 涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后 按常规处理。
• 3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方 法：
㈡ 混匀的方法通常有以下几种：
1. 颠倒混匀：用玻璃纸堵住管口，上下颠倒混 匀。
2.叩击混匀:左手执试管上端，用右手指轻击试 管下半部，使管内溶液作旋转运动。
3.利用旋涡混合（振荡）器混匀。 4.振荡混匀：右手执试管上部，手腕抖动混匀。 5.不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。
㈢ 混匀的注意事项： • ⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。 • ⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。
三. 溶液的混匀
㈠混匀的目的： • ⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接
触，充分进行反应；
• ⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。
电动离心机的使用方法：
• 1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。 并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的 套管相匹配。
• 2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是 否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎 片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格 后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中， 然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往 离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使 之达到平衡。
㈡ 定量吸(移料制成。目前，因产 地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。
• 1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅 速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品 （只换吸嘴即可）。
2.定量吸液器的类型：有两种类型。
生化酶的制备实验报告
一、实验目的1. 理解和掌握生化酶的制备原理和方法。
2. 掌握从生物材料中提取酶的一般步骤。
3. 学习通过不同的方法提高酶的活性。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一、可逆等特点。
在生物体内，酶催化各种生化反应，维持生命活动。
本实验通过从生物材料中提取酶，旨在了解酶的制备过程，并探究影响酶活性的因素。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酵母细胞、鸡肝、鸡蛋清等。
2. 仪器：研钵、离心机、恒温水浴锅、移液器、比色计等。
四、实验步骤1. 酶的粗提取- 将酵母细胞、鸡肝、鸡蛋清等生物材料分别研磨成匀浆。
- 将匀浆分别用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等溶液进行洗涤，以去除杂质。
- 将洗涤后的匀浆离心，收集上清液即为粗酶液。
2. 酶的纯化- 采用不同的层析技术（如凝胶过滤层析、离子交换层析等）对粗酶液进行纯化。
- 通过检测酶活性，确定最佳层析条件。
3. 酶的活性测定- 选择合适的底物和反应体系，通过比色法、紫外分光光度法等方法测定酶活性。
4. 影响酶活性的因素- 研究温度、pH、抑制剂、激活剂等因素对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的粗提取- 通过研磨、洗涤、离心等步骤，成功从酵母细胞、鸡肝、鸡蛋清等生物材料中提取出粗酶液。
2. 酶的纯化- 通过凝胶过滤层析、离子交换层析等方法，成功将粗酶液纯化，得到较纯的酶。
3. 酶的活性测定- 通过比色法、紫外分光光度法等方法，成功测定酶活性，并确定最佳反应条件。
4. 影响酶活性的因素- 通过实验，发现温度、pH、抑制剂、激活剂等因素对酶活性有显著影响。
例如，在一定温度范围内，酶活性随温度升高而增强；在适宜的pH值下，酶活性最高；某些抑制剂可抑制酶活性，而激活剂可提高酶活性。
六、实验结论1. 成功从生物材料中提取出酶，并对其进行纯化。
2. 了解酶的制备原理和方法，掌握酶的活性测定方法。
3. 掌握影响酶活性的因素，为酶的应用提供理论依据。
七、实验讨论1. 在酶的制备过程中，如何提高酶的纯度和活性？2. 如何优化酶的制备工艺，降低成本？3. 酶在生物技术、医药、食品等领域的应用前景如何？八、实验展望1. 进一步研究酶的结构与功能，为酶的应用提供更深入的理论基础。
现代生化技术实验讲义(生物08)
实验一牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定一、实验目的1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。
常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。
本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。
其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
三、材料与试剂市售牛奶10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1M NaOH溶液、0.2M pH4.6的HAc－NaAc缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。
两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。
此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取25ml牛乳置50 ml 烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2 M pH 4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。
生物化学实验操作手册(生物科学专为业)
总论21世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。
生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。
20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。
本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。
同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。
一、实验要求1．实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。
2．实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。
3．实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。
根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。
二、实验时注意事项1．进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。
2．进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。
3．要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。
实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。
4．实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰，乱丢纸屑。
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生化制备技术实验操作指导温州大学生命与环境科学学院2012年2月实验须知1．实验室规则(1) 实验课须遵守实验室开放时间，应自觉遵守课堂纪律，严禁在实验室吃东西、大声喧哗等行为。
每组成员可按个人时间协作完成实验过程，但必须每位成员都参与到实验当中，并由组长预先提交实验分工安排书，交予指导教师作为签到依据。
(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。
(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。
实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。
实验仪器为配套使用，不可随意调换。
每组组长在实验进行之前及结束之后负责对仪器和耗材进行清点，及时反映问题。
(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。
使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。
(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。
课后写出实验报告, 实验课程完全结束后由学习委员收齐交给教师。
(6) 仪器损坏时, 应如实向教师报告, 认真填写损坏仪器登记表。
(7) 实验出现问题，不建议盲目重做，应及时总结原因，给出合理解释。
实验课不完全以最终实验结果为评分依据，更重要的是考察分析问题和解决问题的能力。
(8) 每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。
2．实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。
实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。
实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。
实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。
原始记录必须准确、简练、清楚。
3．实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。
(1)标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。
(2)实验目的(3)实验原理应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。
(4)操作步骤操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。
(5)实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。
建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。
(6)讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。
4．生物化学实验课评分标准◆实验预习情况（20%）◆实验操作情况（20%）◆实验报告情况（20%）——亲和层析法纯化胰蛋白酶实验一鸡卵粘蛋白的提取【实验目的】掌握鸡卵粘蛋白的基本性质以及提取、分离和纯化的基本原理和方法；学习鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶抑制活性测定的基本技术【实验原理】鸡卵粘蛋白是由四个分子量相近的亚基组成的糖蛋白，相对分子量在28000 Da左右，糖基部分主要含有D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸，等电点在3.9-4.5之间。
鸡卵粘蛋白在鸡蛋清中含量丰富，并且与鸡卵清蛋白性质相比，具有较好的化学稳定性。
在80℃条件下,理化性质不发生改变；在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度；在10%的三氯乙酸的溶液中不发生沉淀；在pH3.0的溶液中稳定, 但在pH8.0的溶液中容易分解。
表1. 鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度溶液pH 鸡卵粘蛋白鸡卵清蛋白= 3.5 沉淀5% 溶解95% 沉淀95% 溶解5%< 3.5 沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓> 3.5 沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑通过选择合适的pH值、三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从鸡蛋清中获得鸡卵粘蛋白的粗体液。
如表1.所示，鸡卵粘蛋白和清蛋白在不同pH值的10%TCA溶液中具有不同的溶解状态。
由于鸡卵粘蛋白具有良好的稳定性，在pH3.5的10%三氯乙酸溶液中鸡卵粘蛋白能保持良好的溶解度，而与其共存的清蛋白绝大部分被沉淀出来，这样就可以初步将二者分开。
溶解在10%的三氯乙酸中的鸡卵粘蛋白通过丙酮沉淀而获得粗品，再经阴离子交换柱色谱进一步分离纯化就可获得较纯的鸡卵粘蛋白。
【器材与试剂】1.器材pH酸度计（pH试纸）、磁力搅拌器、圆环、玻璃漏斗、低速离心机、50 ml离心管、滤纸、真空干燥器、循环水式真空泵、储液罐、色谱柱(30×3 cm、20×3 cm)、抽滤瓶、胶塞、恒流蠕动泵、紫外检测仪、记录仪、自动部分收集器、铁架台、双拧丝、万能夹、透析袋、透析袋夹2.试剂（1）10%TCA溶液, pH1.15 (50ml/组)（2）0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl缓冲液, (内含0.2%CaCl2) 200ml（3）2mmol/L BAEE底物溶液200ml（4）1mg/mL Trypsin标准溶液10ml（5）0.2mol, pH6.6, PBS缓冲液120ml (×10)（6）0.3mol/L NaCl –0.02 mol/L , pH6.6, PBS缓冲液100ml（7）0.5mol/L HCl溶液200ml（8）0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH溶液200ml（9）0.5mol/L NaCl 溶液250ml（10）Sephadex G-253.原料新鲜鸡蛋【实验步骤】4.鸡卵粘蛋白的提取（1）提取：取50毫升的鸡卵清放入250毫升烧杯中，边轻轻搅拌边缓缓加入等体积的10% TCA溶液（pH1.15），搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.（2）离心：将鸡卵粘蛋白提取液转移至50毫升离心杯中，平衡后于3000 rpm 离心15min。
收集上清液。
（3）过滤：将上清液用滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物。
（4）调pH值：在pH计上用1 mol/L HCl 将溶液精确调至pH 3.5。
量取体积。
（5）丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
（6）离心：吸出上清部分，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15 min。
（7）除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。
抽去残留丙酮。
（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）（8）溶解：加入25 ml蒸馏水或20 mmol/L，pH 6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
5.鸡卵粘蛋白的分离纯化（1）Sephadex G-25 柱脱盐○1介质预处理：称取15g Sephad ex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
将胶轻轻悬起，待其缓慢沉降后，弃去未能沉降的胶粒。
将胶移入抽滤瓶中，减压抽出气泡。
弃去部分蒸馏水，使蒸馏水与胶的体积比大致为1:2。
○2装柱：取一支30×3 cm 的层析柱，将处理好的Sephad ex G-25装柱，自然沉降。
○3处理：用2倍柱床体积的0.5 mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。
○4平衡：用20 mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。
紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。
○5上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20 ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。
○6收集：在检测仪上观察到开始出现第一个峰时进行收集，待出现第二个峰时停止收集。
见图1图1 Sephadex G-25分子筛层析分离图谱（2）Cellulose离子交换柱层析分离○(1 溶胀：称取20g DEAE-Cellul ose放入500ml的烧杯中, 加入150ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时。
○2装柱：取一支20×3cm 的层析柱，将溶胀好的DEAE-Cellul ose装柱，自然沉降。
○3再生：用200ml 0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8.0。
用200ml 0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH6.0。
○4平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0ml/min。
紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。
○5上样：将经Sephad ex G-25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样，用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，直到仪器绘出稳定的基线。
流速控制在1.0ml/min左右。
○6洗脱：用0.3mol/L NaCl - 20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液。
○7收集：在检测仪上观察到出现高峰时开始收集。
见图2（3）透析及丙酮沉淀图2，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离○1透析：将经DEAE-Cellul ose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内，对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经AgNO3溶液检查无氯离子存在，即可。
○2调pH值：将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调至pH4.0（最好一次调成功），量体积。
○3丙酮沉淀：加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在冰箱内静止4小时以上或过夜。
○4离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min，收集沉淀。
○5干燥：将盛有鸡卵粘蛋白的离心杯放入真空干燥器中干燥。
○6收集鸡卵粘蛋白成品，冰箱保存。
6.活性测定（1）标准胰蛋白酶活性测定（2）自提鸡卵粘蛋白抑制活性测定（3）鸡卵粘蛋白含量测定具体操作见活性测定部分.【实验结果】1.计算鸡卵粘蛋白收率2.计算标准胰蛋白酶的比活性3.计算鸡卵粘蛋白的抑制活性。
【思考题】1.在用10% TCA提取鸡卵粘蛋白为什么将提取液的最终pH调到3.5？2.在用三倍体积丙酮沉淀鸡卵粘蛋白时，为什么第一次丙酮沉淀（10% TCA提取鸡卵粘蛋白离心后的上清液）要将pH调到3.5，而第二次丙酮沉淀（透析后的鸡卵粘蛋白液）中要将pH调到4.0？3.本实验为什么选择DEAE-纤维素阴离子交换色谱分离鸡卵粘蛋白？实验二胰蛋白酶粗提取【实验目的】掌握胰蛋白酶原、胰蛋白酶的基本性质以及蛋白酶提取、分离的基本原理和方法；学习胰蛋白酶活性测定的原理和方法。
【实验原理】胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动物的胰脏或其他组织中。
在底物的诱导下或激活剂的作用下，酶原的C端水解，除去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶。