第二章基因工程制药part
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达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要 表现为： • 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始 密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适 当的范围。
核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有 显著影响，
表达质粒的优化和设计
具体表现为： SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6
核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。
尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱 基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。
在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理 因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶 活力往往能达到比较高的水平。
提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。
由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
高效表达目标基因的战略和技术
表达质粒的优化和设计 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因 提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 高密度发酵和工程化宿主细胞
表达质粒的优化和设计
在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
蛋白质水解酶的特点
细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在 细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。
通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计 学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白 质降解，稳定性较差。
表达质粒的优化和设计
在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征 和特点，注意引入翻译增强子序列
能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻 译增强子。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 IIe 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA
表达质粒的优化和设计
在必要的情况下wenku.baidu.com还可通过顶点突变，PCR等技术 改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5‘端的“茎环”结 构。
把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身 的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’ 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形 下。
一般比较低，不能满足大规模制备的需要。 • 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
慢，使高密度发酵比较困难。 • 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
生物比活力降低，甚至没有活性。 • 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离 去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。 • 对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数 据，而目前这方面的数据库还不完整。
倍。 翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8
个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。 ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与
AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。 ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
表达质粒的优化和设计
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度 有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变。
解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密
码子。 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要 表现为： • 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始 密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适 当的范围。
核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有 显著影响，
表达质粒的优化和设计
具体表现为： SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6
核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。
尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱 基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。
在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理 因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶 活力往往能达到比较高的水平。
提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。
由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
高效表达目标基因的战略和技术
表达质粒的优化和设计 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因 提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 高密度发酵和工程化宿主细胞
表达质粒的优化和设计
在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
蛋白质水解酶的特点
细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在 细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。
通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计 学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白 质降解，稳定性较差。
表达质粒的优化和设计
在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征 和特点，注意引入翻译增强子序列
能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻 译增强子。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 IIe 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA
表达质粒的优化和设计
在必要的情况下wenku.baidu.com还可通过顶点突变，PCR等技术 改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5‘端的“茎环”结 构。
把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身 的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’ 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形 下。
一般比较低，不能满足大规模制备的需要。 • 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
慢，使高密度发酵比较困难。 • 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
生物比活力降低，甚至没有活性。 • 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离 去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。 • 对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数 据，而目前这方面的数据库还不完整。
倍。 翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8
个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。 ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与
AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。 ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
表达质粒的优化和设计
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度 有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变。
解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密
码子。 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆