蛋白质不稳定性分解
蛋白质的不稳定性及其对策
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），
磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，
使用螯合剂
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速；
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
Β-消除反应 转肽作用 外消旋作用 二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀
表面吸附
可能的解决方案
控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度 控制PH、缓冲液 硫醇的消除（如半胱氨酸）
防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长
蛋白质的不稳定性及其对策
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ）， 磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变 影响着蛋白质可溶性和稳定性。 • 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可 能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。 • 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离 子强度。 • 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液 冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速； • 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸 • 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 3.巯基与二硫键 • 在蛋白质的三级结构中，二者起主导作用， 当二硫键交换并导致三维结构发生变化时， 生物活性可能丧失 • 原因：亲核、亲电试剂导致的可逆破坏； • 高温、极端的PH • 二硫键的交换
分子生物学研究中的蛋白质质量控制
分子生物学研究中的蛋白质质量控制在分子生物学研究领域中，蛋白质质量控制是一个至关重要的方面。
蛋白质是细胞中最基本的分子单元之一，它们在生产、运输和代谢等过程中都需要经过精细的调节和控制，以确保它们能够正常地发挥作用。
在这篇文章中，我们将探讨蛋白质质量控制的一些基本概念和方法，以及这些技术如何帮助人们更好地理解和利用蛋白质。
蛋白质合成与质量控制蛋白质合成始于生物学上的核糖体，它们通过读取mRNA序列来合成蛋白质链。
新合成的蛋白质链需要通过复杂的过程来正确折叠，并结合各种辅助蛋白和质量控制机制来确保其正确性。
如果在这个过程中出现了任何问题，那么这个蛋白质可能会被标记为不合适的，然后被分解掉，以免产生损害。
质量控制的工具包括分子伴侣和膜上蛋白。
分子伴侣作为蛋白折叠的助手。
它们可以促进正确折叠和预防错折、聚集和形成沉淀。
在蛋白质分解的过程中，膜上蛋白则起着关键的作用。
它们通过标记和识别质量不佳的蛋白质，以启动它们的分解。
这些标记通常以泛素等小分子为代表。
质谱技术在蛋白质质量控制中的作用质谱是一种分析化学技术，广泛应用于蛋白质质量控制领域。
它基于蛋白质的基本化学属性，如分子量、氨基酸组成、蛋白质的特定修饰、构象状态等方面进行测量和分析。
因此，质谱技术可以用来量化和监测蛋白质合成、折叠和分解等过程中的各种变化。
质谱技术的主要用途之一是在蛋白质质量控制中进行定量分析。
例如，我们可以使用质谱来测量不同蛋白质分子的质量，以评估它们的折叠状态和稳定性。
此外，我们还可以使用质谱技术来监测蛋白质分解和泛素化分解等过程中的不同蛋白质物质和代谢产物的生成。
这可以用来考察某些药物、病毒感染或其他生物学过程的影响。
动态质谱学近年来，动态质谱学也已经成为了研究领域中的重要分支。
该领域涉及到了蛋白质折叠和相互作用过程中的动态变化。
利用动态质谱学技术，科学家可以更好地了解蛋白质折叠、稳定性和泛素化分解等过程中蛋白质的中间状态和亚型。
科学故事1：“N端规则”的发现
科学故事：“N端规则”的发现细胞内的蛋白质从合成出来到被分解之间，往往有一定的“寿命”，而各种蛋白质之间的寿命更有很大的差异。
有的蛋白质一旦被翻译出来就不太会被分解，所以它的寿命甚至比合成它的细胞还长，有的蛋白质则非常不稳定，几乎是一合成出来就被分解掉了。
一般说来，组织细胞必要的结构蛋白寿命都比较长，而负责细胞特殊应变的调节蛋白，其寿命往往就很短。
但是细胞究竟透过哪一些机制来决定蛋白质的寿命，对科学家一直是一项重大的挑战。
直到20世纪80年代，MIT的Alexander Varshavsky终于摸索到了一些规律，称作N端规则。
也就是说，一般蛋白质在细胞内的分解速率，由其N端氨基酸的种类来决定。
它的发现过程十分曲折有趣，值得向大家介绍。
Varshavsky起初只是对泛素的功能有兴趣，有一次他获悉东京大学的Yamada得到一个有趣的温度敏感型细胞突变株，这种变种细胞在高于允许温度的条件下不会分裂。
而Yamda也发现，这个变种细胞主要的问题在于它无法将泛素连接到别的蛋白质上，原因是负责这个反应的酶发生了变异，在允许温度之上就失去了活性。
Varshavsky就想到利用这个变种细胞来探讨泛素和蛋白质分解的问题。
当时，许多科学家都认为，泛素是决定蛋白质寿命的一个重要因素。
根据这个理论，泛素会和那些要被消化的蛋白质结合，而使它们得以分解。
如果这个理论是对的，那么，Yamada发现的变种细胞在允许温度之上无法将泛素接到蛋白质上，在这样的条件下，变种细胞内的蛋白质将无法被分解。
Varshavsky做了一个简单的实验，将细胞放在允许温度之上培养，然后直接观察细胞里一些半衰期很短的蛋白质。
结果发现那些蛋白质在允许温度之上时都变得十分稳定。
这是第一个直接的证据显示，如果泛素不加到蛋白质上，那个蛋白质就不会被分解。
泛素通常是接在蛋白质的氨基酸残基侧链的氨基上。
但利用遗传工程的方法，可以把泛素接到一个蛋白质的N端，制造出单链的融合蛋白，然后直接比较这个蛋白质在接上泛素前后，被分解的情形如何，就可以帮助我们了解泛素在蛋白分解过程中扮演的角色。
第二章 蛋白质不稳定性
叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（二）范德华力（范德华相互作用）： 广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即： 定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永 久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范 德华力； 诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是 永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相 互作用； 分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉 淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如 温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
五、包含体的形成与性质
现代研究表明：在大多数情况下，包含体 的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋 白质的种类和表达系统无关，即包含体的 形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠 途径等内在性质没有必然的联系。换句话 说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在 过量表达的情况下都可能形成包含体。 蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力 学竞争的结果。
生物技术药物制剂
一、蛋白质类药物的一般处方组成 目前临床上应用的蛋白质类药物注 射剂，一类为溶液型注射剂， 射剂，一类为溶液型注射剂，另一类是 冻干粉注射剂。 冻干粉注射剂。
二 、 液体剂型中蛋白质类药物 的稳定化
液体剂型中蛋白质类药物的稳定化 方法分为两类 ①改造其结构 ②加入适宜辅料
蛋白质类药物的稳定剂
1、缓冲液 因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值 因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值 pH 有关， 通常蛋白质的稳定pH 值范围很窄， pH值范围很窄 有关 ， 通常蛋白质的稳定 pH 值范围很窄 ， 应采用适当的缓冲系统， 应采用适当的缓冲系统 ， 以提高蛋白质 在溶液中的稳定性。 在溶液中的稳定性。
§19-3 19-
蛋白质类药物新型给药系统
蛋白质、多肽药物一般注射给药， 蛋白质、多肽药物一般注射给药，基 本剂型是注射液和冻干粉针， 本剂型是注射液和冻干粉针，但常需频繁 注射。 注射。 因此可以自行给药的制剂（ 因此可以自行给药的制剂（如非注射 给药）一直是研究热点， 给药）一直是研究热点，同时注射给药系 如缓释控释）也在不断创新， 统（如缓释控释）也在不断创新，以便给 药更为方便、有效、持久。 药更为方便、有效、持久。
（一）鼻腔给药系统
鼻腔给药的方式 有滴鼻给药法和喷雾 鼻腔 给药的方式有滴鼻给药法和喷雾 给药的方式 给药法， 给药法，采用后一种方法可获得较高的生 物利用度。 物利用度。 鼻腔给药存在的问题有刺激性、 鼻腔给药存在的问题有刺激性、对纤毛 有刺激性 的损害或妨碍、 的损害或妨碍、大分子药物吸收仍较少或 吸收不规律等， 吸收不规律等，尤其是长期用药还有待于 评价；鼻腔中的酶不能完全忽视。 评价；鼻腔中的酶不能完全忽视。
2、蛋白质的不稳定性
②凝聚与沉淀 ③表面吸附 蛋白质易吸附于相界面， 蛋白质易吸附于相界面，多因蛋白质 疏水性和静电引起。吸附常引起失活。 疏水性和静电引起。吸附常引起失活。
分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策
。
在许多情况下 , 天然蛋白质仅受到蛋白酶的缓慢水 解, 而部分变性的解折叠蛋白质则增大了蛋白水解 酶水解的可能性。微生物的污染极有可能给分离纯 化系统带入蛋白酶。蛋白酶除了造成对肽键的破坏
, Asn 脱酰胺形成的五元琥珀酰亚胺中间产物更
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外, 在高温水溶液条件下 还会造成 Asp 的肽水解、 Gln 和 Asn 侧链的脱氨基、 Cys 侧链的 去除及二硫 键交 换 , 从 而 对 肽 链 再 折 叠 产 生 极 其 严 重 的 影 响
5) Asn 和 Gln 脱酰胺作用
2 如果一级结构没有变化, 三级或四级结构变化也
热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋 白来说, 平均 150 个氨基酸残基中只有一个盐桥处 于内部, 其它都在分子表面。因此 , 参与稳定蛋白质 的可能是处于分子表面的那些离子键 的稳定性
[ 8, 9] [ 10]
5) 不正确的折叠形式或形成错配的二硫键 从动力学上讲 , 蛋白质在提纯过程中活性的丧 失可能是由天然状态 N 经过一系列相对稳定的中 间态 U 1 , U 2 . . . 而最终达到变性状态 D[ 3] : N U1 U2 D 一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性, 是一个可逆过程, 而成为变性态则有的是可逆的 , 有 的是不可逆的。 1 1 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要 的乃至决定性的作用[ 4] 。Yatani 等人证实蛋白质的 稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决 于蛋 白 质 分 子 内 部 疏 水 性 氨 基 酸 的 个 数[ 5] 。 Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶 稳定性高的原因 , 结果表明 [ 6] , 嗜热酶分子内 部疏 水性氨基酸含量高 , 具有更紧密的疏水核。 氢键和离子键对 稳定性也有作 用。 Pace 等人 发现 [ 7] , 氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同 的甚至更 高的稳定作用 [ 8] 。许多研究者证 实[ 9] 嗜 67
生物技术药物制剂
新疆医科大学教案首页编号：_1－33_第十八章生物技术药物制剂第一节概述一、生物技术的基本概念1、生物技术或称生物工程（biotechnology），是应用生物体（包括微生物、动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。
2、现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程、发酵工程（微生物工程）与生化工程。
二、生物技术药物的结构特点与理化性质（一）蛋白质的结构特点蛋白质的组成和一般结构（一、二、三、四级结构）（二）蛋白质的理化性质1．蛋白质的一般理化性质：旋光性、紫外吸收、蛋白质两性本质与电学性质（1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。
蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。
（2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。
氨基酸在紫外230nm显示强吸收。
（3）蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。
这些基团在一定 pH条件下都能发生解离而带电。
因此蛋白质是两性电解质，在不同 pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。
2．蛋白质的不稳定性（1）由于共价键引起的不稳定性：水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换（2）由非共价键引起的不稳定性：聚集（aggregation）、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性（三）蛋白质类药物的评价方法：多种分析方法：液相色谱法、光谱法、电泳、生物活性测定与免疫测定第二节蛋白质类药物制剂的处方与工艺（注射剂型）一、蛋白质类药物的一般处方组成：一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化：①改造其结构；②加入适宜辅料蛋白类药物的稳定剂：缓冲液、表面活性剂、糖和多元醇、盐类、聚乙二醇类、大分子化合物、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等、金属离子1．缓冲液因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值有关，通常蛋白质的稳定pH值范围很窄，应采用适当的缓冲系统，以提高蛋白质在溶液中的稳定性。
蛋白质的不稳定性及其对策分解
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长 小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化） Β-消除反应 转肽作用 可能的解决方案 控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导 致低物理稳定性。 • 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• • • •
1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋 白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率 • 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速 率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
体内蛋白质分解代谢的最终产物
体内蛋白质分解代谢的最终产物一、概述蛋白质是构成生物体的重要组成部分，它们参与到体内的许多重要生理活动中。
蛋白质分解代谢是蛋白质在体内被分解并代谢的过程，其最终产物对人体健康至关重要。
本文将介绍体内蛋白质分解代谢的最终产物及其对人体健康的影响。
二、蛋白质分解代谢的过程1. 蛋白质分解蛋白质在体内首先被水解酶分解成氨基酸，这是蛋白质分解代谢的第一步。
氨基酸是蛋白质的基本组成单元，其在体内具有多种重要生理功能。
2. 氨基酸代谢氨基酸在体内经过一系列酶促反应，被转化为其他物质，包括能量物质和合成物质。
其中重要的产物包括尿素、谷氨酸、丙酮酸等。
三、体内蛋白质分解代谢的最终产物1. 尿素尿素是氨基酸代谢的最终产物之一，它由肝脏合成，并通过肾脏排出体外。
尿素的主要作用是将体内产生的过量氨基酸转化为较为稳定的尿素，从而维持体内氮平衡。
2. 谷氨酸谷氨酸是氨基酸代谢的重要产物，它参与到体内许多代谢途径中，包括糖异生、丙酮酸循环等。
谷氨酸还是脑内的重要神经递质，对维持神经系统的正常功能至关重要。
3. 丙酮酸丙酮酸是氨基酸代谢的重要产物之一，它可用于肌肉运动时的能量供应，也可以通过丙酮酸循环转化为葡萄糖，参与到血糖的调节过程中。
四、体内蛋白质分解代谢产物对人体健康的影响1. 尿素及氮平衡尿素的产生和排泄对维持体内氮平衡起着重要作用，它能够帮助人体排出多余的氮负荷，维持血液中氨基酸的平衡。
如果氮平衡失调，可能导致氮中毒等健康问题。
2. 谷氨酸及神经系统功能谷氨酸是体内重要的神经递质之一，它参与到神经系统的正常功能中。
如果谷氨酸代谢失调，可能导致神经系统功能异常，出现头晕、记忆力下降等症状。
3. 丙酮酸及能量供应丙酮酸作为能量供应物质，如果其产生不足或过多，可能导致人体能量供应不足或代谢异常，从而影响体内代谢平衡。
五、结语体内蛋白质分解代谢的最终产物对人体健康有着重要影响，其平衡与否关系着人体的正常生理功能。
通过了解体内蛋白质分解代谢的最终产物及其影响，可以更好地维护人体健康。
《蛋白质不稳定性》课件
蛋白质二级结构与稳定性
总结词
维持蛋白质二级结构的完整性有助于保持其稳定性。
详细描述
为了维持蛋白质的稳定性，需要保持其二级结构的完整性。这可以通过保持适当的氨基酸序列和避免突变来实现 。此外，环境因素如温度、pH和离子强度等也会影响蛋白质的二级结构和稳定性。因此，了解这些因素对蛋白 质稳定性的影响对于维持其功能至关重要。
蛋白质二级结构是指局部主链的折叠 方式，对蛋白质的整体稳定性有重要 影响。
要点二
详细描述
蛋白质的二级结构是指局部主链的折 叠方式，包括α-螺旋、β-折叠、β-转 角和无规卷曲等。这些折叠方式决定 了蛋白质的三级结构，进而影响其整 体稳定性。例如，α-螺旋结构可以增 加蛋白质的稳定性，而β-折叠结构则 可能降低稳定性。
通过X射线晶体学、核磁共振等技术 可以解析蛋白质的三级结构，进一步 了解其稳定性机制。
详细描述
解析蛋白质的三级结构是了解其稳定 性和功能的关键步骤。通过X射线晶 体学、核磁共振等技术可以解析出蛋 白质的三维构象，从而更好地理解其 稳定性和功能机制。这些技术对于研 究蛋白质的结构与功能关系、设计新 药物和开发新型生物材料等方面具有 重要意义。
详细描述
蛋白质的不稳定性可以被用来调控材料表面的生物活性，从而实现特定的生物医学工程应用。例如， 通过控制材料表面的电荷和疏水性等物理化学性质，可以调控蛋白质在材料表面的吸附和构象变化， 进而影响细胞的生长和分化等过程。
05
蛋白质不稳定性研究展望
蛋白质不稳定性研究现状与挑战
总结词
当前蛋白质不稳定性研究的进展和存在的挑战。
03
蛋白质不稳定性检测方法
热稳定性检测
总结词
通过加热蛋白质样品，观察其稳 定性变化。
蛋白纯化面试知识
蛋白纯化面试知识1. 背景介绍蛋白纯化是生物学研究中非常重要的一步，它是从复杂的混合物中分离和纯化特定蛋白质的过程。
蛋白纯化技术可用于生物制药、生物化学研究、结构生物学等领域。
在蛋白纯化面试中，考官通常会提问与蛋白纯化相关的知识，下面将介绍一些常见的面试问题和答案。
2. 常见面试问题及答案2.1 什么是蛋白纯化？蛋白纯化是指从复杂的混合物中分离和纯化特定蛋白质的过程。
它包括样品预处理、分离和纯化等步骤。
蛋白纯化的目的是获得高纯度的蛋白质，以便进行后续的实验和研究。
2.2 蛋白纯化的常用方法有哪些？蛋白纯化的常用方法包括：•亲和层析：利用蛋白质与亲和柱上的配体之间的特异性相互作用来实现纯化。
•凝胶过滤层析：根据蛋白质的分子量大小选择合适的凝胶，使较大分子的蛋白质无法进入凝胶孔隙而被分离。
•离子交换层析：利用蛋白质与离子交换柱上固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
•凝胶电泳：利用电场对蛋白质进行分离，分离效果与蛋白质的电荷、分子量有关。
•透析：通过半透膜使目标蛋白质与其他小分子物质分离。
2.3 如何确定蛋白纯化的效果？确定蛋白纯化的效果通常需要进行以下几个方面的检测：•SDS-PAGE凝胶电泳：通过凝胶电泳分离蛋白质，观察蛋白质的相对分子质量和纯度。
•Western blotting：通过将蛋白质转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，进一步确认目标蛋白质的纯度。
•比浊法：利用蛋白质在紫外线下的吸光性来检测蛋白质的浓度。
•酶活性测定：通过检测目标蛋白质的酶活性来评估纯化效果。
2.4 在蛋白纯化过程中可能遇到的问题有哪些？在蛋白纯化过程中，可能会遇到以下问题：•低产量：蛋白质表达量较低，导致蛋白纯化的困难。
•杂质污染：混合物中存在其他蛋白质、核酸或小分子物质，影响目标蛋白质的纯化。
•蛋白质不稳定性：某些蛋白质容易失活或聚集，需要进行适当的条件优化。
•蛋白质结构问题：某些蛋白质存在复杂的结构，需要利用多步骤的纯化策略。
蛋白质不稳定性与抗体异质的影响因素-txz
•
•
最常见的是异天冬氨酸形式。不仅来源于Asp的直接异构化，还来源于琥 珀酰亚胺的水解。琥珀酰亚胺中间体依赖pH形成，由Asn脱酰胺或Asp脱 水。中性和碱性下，isoAsp和Asp产物大概比例3：1。 CDR区 H102的Asp 异构化活性将至9-21%。L32的Asp降低Fab2相对活性至42%，两条链都异 构化时降至15%。琥珀酰亚胺形成不需要水的参与，因此在冻干状态也会 发生。无论在Tg温度上下，升高保存温度都会增加异构化。 空间效应也强烈影响异构化速率。CDRs内两个Asp-Gly序列，只有一个位 点发现对异构化易感，另一个则不会发生，可能跟氢键有关。
C-端赖氨酸加工
• 最常见的修饰之一 • 重链C端编码有Lys，但是由于碱性羧肽酶的 活性使其部分或完全移除 • 移除后分子量减小128Da，正电基团减1 • 部分移除时，产生分别含0,1,2个C端Lys的重 链，电荷差异使IEF上可区分多条带，或者 离子交换多个峰。HIC或RP也有分离作用。 • 羧肽酶B处理可减少这方面的异质性。
– 出现88kD条带，L46-52 and H99-121 之间。氧化作用的抑制可以延迟这种 交联。 – a nonreducible thioether bond can be formed between C223 of the heavy chain and the C-terminal Cys residue of the light chain in humanized IgG1 antibodies。质谱75kD，PAGE胶是92kD。冻干的固体剂型中也会发生，at 568C for 18 days led to forma-tion of 100-kDa band under reduced conditions by SDS–PAGE
蛋白质低温失火-概述说明以及解释
蛋白质低温失火-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在食品加工和储存过程中，蛋白质的性质和稳定性是至关重要的。
随着科技的不断发展，人们对蛋白质在低温条件下的稳定性也越来越关注。
低温失火是指蛋白质在低温下出现的变性和降解现象，这会导致食品质量的下降，甚至影响人体健康。
本文将探讨低温对蛋白质的影响、蛋白质失火的表现及可能的原因，并提出一些预防措施和未来研究方向，以期为食品加工和储存提供更科学的指导。
文章结构部分描述了整篇文章的框架和各部分内容的主题。
在这篇关于蛋白质低温失火的长文中，文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 低温对蛋白质的影响2.2 蛋白质失火的表现2.3 可能的原因3. 结论3.1 总结低温失火的影响3.2 探讨预防措施3.3 展望未来研究方向文章结构部分的目的是让读者了解整篇文章的篇章分明，各部分内容的主题，并为后续阅读提供方向和线索。
文章1.3 目的部分的内容如下：在这篇文章中，我们的主要目的是探讨蛋白质在低温条件下失火的现象，并分析其可能的原因。
通过对低温对蛋白质的影响以及蛋白质失火的表现进行深入研究，我们希望能够更全面地了解这一现象，并提出相应的预防措施。
同时，我们还将探讨未来在这一领域的研究方向，为进一步探究蛋白质在低温条件下失火提供理论支持。
通过本文的分析，我们希望加深人们对蛋白质失火问题的认识，促进相关研究的发展，为保障蛋白质质量和安全性提供参考和建议。
2.正文2.1 低温对蛋白质的影响在低温环境下，蛋白质会遭受一系列的影响，其中最显著的是构象变化和活性丧失。
低温会导致蛋白质的分子结构发生改变，特别是在冰冻条件下，蛋白质分子中的水分会结晶化，造成蛋白质结构的破坏。
这种结构改变会使蛋白质的功能受到影响，包括其生物活性和功能性。
此外，低温还会影响蛋白质的溶解性和稳定性。
在低温条件下，蛋白质可能会发生聚集，形成聚集物或凝胶，造成蛋白质失去水溶性。
蛋白质不稳定性
蛋白质不稳定性
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。
蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动 力学竞争的结果。
五、包含体的形成与性质
U ki I kr
N
ka
A
其中：U为伸展肽链；I为折叠过程的中间态；N为天 然活性态；A为聚集体（包含体），ki、kr、ka分 别为中间体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体 生成速率常数。
活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速 率与浓度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发 生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数 ≥2。因此，如果新生肽浓度增加和中间态的疏水 相互作用就可能导致包含体的形成。
三、环境因素对蛋白质稳定性的影响
物理因素：温度、紫外线照射、高压和表面张 力等；
化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如 尿素和盐酸胍，一方面能与多肽主链竞争氢键， 破坏蛋白质的二级结构；更重要的是它们可以 增加非极性侧链在水中的溶解度，因而降低了 维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。
酶的作用：一些蛋白质分解酶类的作用。 微生物因素：微生物分解利用蛋白质进行生长
带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现，它们一般与其他 基团形成强的氢键，但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链 在分子的疏水作用内部形成盐键。在疏水环境中，介电常 数比在水中低，相反电荷间的吸引力相应增大。当荷电侧 链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列的水分子被 释放到介质水中，因此，盐键的形成不仅是静电吸引而且 也是熵增加的过程。升高温度，可以增加盐桥的稳定性。 此外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。
药品蛋白的稳定性：升级版
药品蛋白的稳定性：升级版摘要：1989年，manning,patel,和borchardt写了一篇关于蛋白稳定性的文章，这个文章大量的参考了以前的工作。
当时,重组蛋白治疗还处于初级阶段。
这篇综述总结了关于蛋白稳定性和剂型的进步。
另外讨论了当前已知的蛋白质化学和物理的不稳定性，部分章节还包括蛋白在水溶液和干粉状态下化学和物理的不稳定性。
使用化学改造和诱变提高稳定性及化学和物理的相互作用的不稳定性。
介绍：1989年，manning,patel和borchardt写了一篇综述总结了那时已知的蛋白药品的稳定性和稳定，这篇文章被引用了500次，二十世纪八十年代晚期，在美国市场仅有三种重组蛋白产品：orthoclone(okt-3),人胰岛素和tissueplasminogenactivator.。
如果一个包含血浆来源的产品，获准的生产的蛋白仅有十二个。
显然的，重组dna技术已经极大地改变了药品市场。
现在仅仅在美国市场以有近20种抗体产品和几乎150种以蛋白为基础的产品被普遍应用。
另外的，我们所知的关于蛋白稳定性和剂型已经急剧的增加。
本篇综述的目的是阐述过去20年中我们所了解的蛋白稳定性的进步。
除了更新原有的评论文章的部分，在1989年的文献中没有被讨论的主题在这篇文章中被讨论，例如发生在生物过程中的蛋白质化学和物理的不稳定性的相互关系，生物加工过程中冻干周期对蛋白质的稳定性影响，以及在维持蛋白质稳定性的过程中包装的重要性。
我们把蛋白不平衡分成两种：化学不稳定性和物理不稳定性。
化学不稳定性牵涉共价键的制备和脱落的过程，分解成代莱化学实体。
表中一中列举一个较为常用的化学降解过程。
恰好相反，蛋白质的物理不稳定性其化学成分并没发生改变，而是蛋白质物理状态的发生改变。
这包含变性，涌入，结晶，溶解（见到表中1）。
结晶被用在这里就是指不溶性而不是不溶性聚集体构成。
我们关于所有蛋白降解途径的知识有很大提高比20年前。
因此，这篇文章的重点是自从1989年以来取得的进步。
蛋白不稳定指数
蛋白不稳定指数
蛋白不稳定指数是衡量蛋白质稳定性的一种指标。
蛋白质是生命体内的重要组成部分，其稳定性对生命活动和代谢过程至关重要。
蛋白质不稳定性可能导致蛋白质失去功能、变性或降解，进而影响生命活动的正常进行。
蛋白不稳定指数是指在一定条件下，蛋白质发生变性的浓度或温度，是衡量蛋白质稳定性的重要参数之一。
蛋白不稳定指数可以通过实验手段测定，常用的方法有圆二色谱、荧光光谱、差示扫描量热法等。
通过测定蛋白不稳定指数，可以评估蛋白质的稳定性，为药物设计、酶工程等领域提供重要参考。
蛋白不稳定指数的研究涉及蛋白质的结构、构象、动力学等方面，是生命科学、药学等领域的热点研究方向。
未来，随着技术的发展和研究的深入，蛋白不稳定指数的应用将会越来越广泛，为生命科学和医药领域带来更多的突破和进展。
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高温会分解的蛋白质
高温会分解的蛋白质
蛋白质是生命体中非常重要的分子之一，但是在高温环境下，蛋白质会分解，从而失去其原本的功能和结构。
这是因为高温会使蛋白质中的氢键、离子键和疏水作用受到破坏，导致蛋白质分子的三维结构发生变化。
这种变化会导致蛋白质的结构变得不稳定，容易被酶或其他分子降解。
此外，高温也会导致蛋白质的氨基酸发生氧化和脱羧反应，进一步加速蛋白质分解的过程。
因此，在烹饪和加热食物时，我们应该避免使用过高的温度，以免影响蛋白质的质量和营养价值。
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蛋白质的不稳定性及对策
刘耀玺
河南科技大学林业职业学院 生物技术教研室
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序 列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称 空间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质 DNA 的核苷酸序列决定的。 肽键（ CO-NH ）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（ -S-S- ）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（一）氢键： 氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的 作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢 键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外， 氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链 肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。 大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主 链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α螺 旋、β折叠），与此同时保持大多数能成氢键的 侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。
Байду номын сангаас
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（三）疏水作用： 水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在 分子的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳 定蛋白质的三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并 不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或 疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。当然，当疏水基 团接近到等于范德华距离时，相互间将有弱的范德华引力， 但这不是主要的。蛋白质溶液中的熵增加是疏水作用的主 要动力。 疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强，但超过一 定温度后（50-60℃，因侧链而异），又趋减弱，因为超 过这个温度，疏水基团周围的水分子有序度降低，因而有 利于疏水基团进入水中。 非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用的试剂，因此是变性 剂。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，因 此是强变性剂。
一、蛋白质失活的机制
蛋白质不稳定（失活）的表现分为两种，即化学 不稳定和物理不稳定。 化学不稳定是指蛋白质分子通过共价键的形成和 断裂形成新的化学实体； 物理不稳定指蛋白质分子的高级结构的物理转变， 无共价键改变。物理不稳定包括变性、聚集、沉 淀和表面吸附。 蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其 原有生理活性，产生新的功能活性或完全丧失生 物活性。但物理不稳定现象一般可以通过特定的 途径恢复其空间结构，而恢复原有的活性，我们 称这一过程为蛋白质的复性。
氢键 13-30KJ/mol-1 范德华力 4-8 KJ/mol-1 疏水作用 12-20 KJ/mol-1 （注意：疏水作用的 数值表示在25℃非极性侧链能够从蛋白质内部转 移到水介质中所需的自由能，它与其他键的键能 不同，此数值在一定范围内随温度的升高而增加。 实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于 伸展过程中键的断裂。） 盐键 12-30 KJ/mol-1 二硫键 210 KJ/mol-1
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（四）盐键： 又称盐桥或离子键。它是正电荷与负电荷之间的一种静电 相互作用。在生理pH下,蛋白质中的酸性氨基酸（天冬氨酸 和谷氨酸）的侧链可离解成负离子，碱性氨基酸（赖氨酸、 精氨酸和组氨酸）的侧链可离解成正离子。在多数情况下 这些基团都分布在球状蛋白质分子表面，而与介质水分子 发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层， 这对稳定蛋白质的构象有着一定作用。 带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现，它们一般与其他 基团形成强的氢键，但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链 在分子的疏水作用内部形成盐键。在疏水环境中，介电常 数比在水中低，相反电荷间的吸引力相应增大。当荷电侧 链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列的水分子被 释放到介质水中，因此，盐键的形成不仅是静电吸引而且 也是熵增加的过程。升高温度，可以增加盐桥的稳定性。 此外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（二）范德华力（范德华相互作用）： 广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即： 定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永 久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范 德华力； 诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是 永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相 互作用； 分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度 的波动，即电子运动的不对称性造成的。瞬时偶极可 以诱导周围的分子或基团产生诱导偶极，诱导偶极反 过来又稳定了原来的偶极，因此它们之间产生了相互 作用。 狭义的范德华力是一种很弱的作用力，而且随 非共价键合原子与分子间距离（R）的6次方的倒数而 变化。虽然就个别来说，范德华力是很弱的，但是范 德华相互作用数量大，并且具有加和效应和位相效应 （当分子或集团相同时，其瞬间偶极矩同位相，从而 产生最大的相互作用），因此，就成为一种不可忽视 的作用力。