免疫组织化学切片再行荧光原位杂交检测方法的探索

免疫组织化学切片再行 ＦＩＳＨ 检测时，这些切片要经过 高压、高温、酶消化及多次洗涤等步骤，所以为了防止组织脱 片，本实验中所用的玻片均为涂胶片，且整个处理过程中操 作要轻柔 （ 如揭掉盖玻片）， 水 洗和 浸 泡的 时间 不 要过 度 延长。
行切片。 或者部分会诊患者带来的白片数量有限，前期 ＨＥ、 免疫组织化学检测已经用完，而返回原就诊医院借蜡块既不 方便，又延误患者的及时诊治，并增加经济负担。 在这种情 况下，面对已有的多张免疫组织化学切片，我们尝试将免疫 组织化学染色阴 性 的切片 经 ９６ ℃ 水 浴 处 理 后 重 新 进 行 ＦＩＳＨ 检测，并取得了良好的效果。
和 ＦＩＳＨ 中的操作完全相同） 或微波在上述两种方法中作用
（ 收稿日期：２０１４－０４－２９）
镜下观察 时， 红 色 背 景 非 常 深， 甚 至 出
现点状至片状的荧光物质，严重干扰了
红信号的 判 读， 即 使 增 加 洗 涤 时 间， 这
些物质也不易被清除。 经过反复实验
及分析，我们发现若在胃蛋白酶消化之
前增加一个 ９６ ℃水浴处理的过程，可
使 ＦＩＳＨ 结果中的红色背景大大降低，
红色信号清晰明确。 原因可能是 ９６ ℃
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中华病理学杂志 ２０１４ 年 １１ 月第 ４３ 卷第 １１ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｖｏｌ．Fra bibliotek３，Ｎｏ．１１
后，直接进入到 ＦＩＳＨ 检测的胃蛋白酶
消化过程，因为打开交联的过程在免疫
组织化学中已经进行。 实验结束后，选
用 Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ 滤光片在荧光显微
４畅结果判定［３－５］ ：伯基特淋巴瘤至少计数 １００ 个肿瘤细 胞，正常的分裂间期细胞核可见到 ２ 个融合信号（ 黄色信号 或红绿色信号连在一起）；当基因断裂时，多于 ２０％的肿瘤 细胞核内出现 １ 个融合的黄色信号、１ 个单独的绿色信号和 １ 个单独的红色信号；套细胞淋巴瘤至少计数 １００ 个肿瘤细 胞，正常分裂间期细胞核显示 ２ 个单独红色的信号和 ２ 个单 独的绿色信号；当基因易位时，多于 ５％肿瘤细胞核内出现 ２ 个融合的黄色信号、１ 个单独的绿色信号和 １ 个单独的红 色信号。 乳腺浸润性导管癌计数 ２０ 个肿瘤细胞，统计 Ｒａｔｉｏ 值（Ｒａｔｉｏ 值 ＝２０ 个细胞核中红色信号总数 ／２０ 个细胞核中 绿色信号总数）；Ｒａｔｉｏ 值≤１畅８ 为阴性，提示该样本无 ＨＥＲ２ 基因扩增；Ｒａｔｉｏ 值≥２畅２ 为阳性，提示样本中 ＨＥＲ２ 基因发 生扩增；Ｒａｔｉｏ 值在 １畅８ ～２畅２ 之间，可增加细胞计数或重做 ＦＩＳＨ 来判断最终结果。
中华病理学杂志 ２０１４ 年 １１ 月第 ４３ 卷第 １１ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１１
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· 技术交流·
免疫组织化学切片再行荧光原位杂交检测方法的探索
滕孝静 王卫东 王凤 程鸣 谢建兰 周小鸽
荧光原位杂交（ ＦＩＳＨ） 技术是一种分子细胞遗传学技 术，其原理是通 过 标 记 有 荧 光 素 的 探 针 与 特 异 性 的 染 色 体 和 ／或基因位点相结合，在细胞核中检测染色体和相应基因 的变化［１］ 。 ＦＩＳＨ 技术被认为是目前检测乳腺癌 ＨＥＲ２ 基因 状态最准确、可重复性最高的方法，是当今白血病 ／淋巴瘤诊 断和分型的重要手段之一，在发达国家正成为常用的辅助诊 断技术。 临床病理诊断中，常会遇到前期 ＨＥ、免疫组织化学 染色之后，要做 ＦＩＳＨ 检测时，因组织太小或会诊的白片用完 以致不能进行 ＦＩＳＨ 检测。 我们在工作中经过反复实验，尝 试将免疫组织化学染色后的阴性切片，重新进行 ＦＩＳＨ 检测， 摸索出一种简便有效的方法，现介绍如下。
９６ ℃水浴能大大降低实验组的红 色背景，使 红 色 信 号 的 计 数 不 受 干 扰， 但是与对照组相比，其红色背景还是要
中，ＨＥＲ２ 基因发生扩增 图 4 实验 组伯基 特淋巴 瘤中 出现 Ｃ－ｍｙｃ 基因断 裂，与图 １ 来
略深，这是由于免疫组织化学染色时的
自同一病例，红色背景较图 １ 略深 图 5 实验组套细 胞淋巴 瘤中出现 ＩｇＨ ／ＣＣＮＤ１ 基因 融合，与图 ２ 来自同一病例，红色背景较图 ２ 略深 图 6 实验组乳腺浸润性导管癌病例 中，ＨＥＲ２ 基因发 生 扩 增， 与 图 ３ 来 自 同 一 病 例， 红 色 背 景 较 图 ３ 略 深 图 １ ～６ 均 为 ＦＩＳＨ 法 ×１ ０００
实验中我们也尝试了将免疫组织 化学染色细胞核阳性和细胞膜阳性的切片再行 ＦＩＳＨ 检测， 但因为棕黄色颗粒不被本实验的任何试剂和操作褪去颜色， 所以在荧光显微镜下，细胞核内由于棕黄色颗粒的沉着，几 乎观察不到荧光信号。 而细胞膜处的棕黄色颗粒使切片呈 云雾样，核分界不清，核内红色信号较弱，不利于计数。
水浴有助 于 将 前 期 处 理 过 程 中 黏 附 在
组织上， 可 能 产 生 荧 光 背 景 的 色 素 沉
渣、明胶以及其他杂质等清除干净。
图 1 对照组伯基特淋巴瘤中出现 Ｃ－ｍｙｃ 基因断裂：１ 个融合信号、１ 个单独的绿色信号和 １ 个单独的红色信号 图 2 对照组套细胞淋巴瘤中出现 ＩｇＨ ／ＣＣＮＤ１ 基因融合：２ 个融合 信号、１ 个单独的绿色信号和 １ 个单独的红色信号 图 3 对照组乳腺浸润性导管癌病例
三、讨论 近年来，我院 病 理 科 接 收 来 院 会 诊 的 疑 难 病 例 越 来 越 多，在实际工作中，常会遇到有些病例，虽然已做了 ＨＥ 及多 项免疫组织化学标记，仍因无法确诊或为了判断预后、指导 治疗而需要继续进行 ＦＩＳＨ 检测。 此时部分穿刺、内窥镜等 方式取材的标本，由于蜡块上的小组织已所剩无几，难以再
一、材料与方法 １畅材料：收集首都医科大学附属北京友谊医院病理科 ２０１２ 年 ４ 月至 ２０１４ 年 ４ 月间的存档石蜡组织及切片，选取 确诊为伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤及乳腺浸润性导管癌的 病例各 １０ 例，这些病例均做过免疫组织化学和 ＦＩＳＨ。 每例 从各自的免疫组织化学切片中分别选出细胞膜 ／质阴性（ 相 应抗体为 ｂｃｌ－２、ＣＤ１０、ＣＫ５ ／６） 和细胞核阴性 （ 相应抗体为 ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－１、孕激素受体） 的切片各 １ 张，组成实验组。 另切取白片 １ 张（ 与对应的免疫组织化学切片来自同一蜡 块），组成对照组，单独进行 ＦＩＳＨ 检测。 相应的 Ｃ－ｍｙｃ 双色 分离重 排 探 针、 ＩｇＨ ／ＣＣＮＤ１ 双 色 融 合 探 针 及 ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ２ ＤＮＡ 探针试剂盒购自美国 Ａｂｂｏｔｔ ／Ｖｙｓｉｓ 公司。 荧光 显微镜为德国蔡司公司的 Ｉｍａｇｅｒ畅Ｍ２ 型。 免疫组织化学抗 体购于福州迈新生物技术有限公司。 ２畅方法：免疫组织化学染色采用 ＥｌｉＶｉｓｉｏｎ 两步法，修复 方法采用高压或微波修复。 对照组切片按本实验室常规 ＦＩＳＨ 操作方法进行。 组织切片置于 ６５ ℃温箱过夜烘烤。 常规脱蜡、水化后，置入煮沸 ＥＧＴＡ 修复液的高压锅内，加热 直至气阀喷气后 ２ ｍｉｎ，在自来水冲洗下减压后，取出切片， 随后放入 ３７ ℃的 ０畅５ ｇ ／Ｌ 胃蛋白酶（Ｓｉｇｍａ 公司） 溶液中消 化 １０ ～４０ ｍｉｎ，蒸馏水冲洗两次，梯度乙醇脱水，自然干燥玻 片。 在组织上标记区域内分别加入相应探针，橡胶水泥封 片。 原位杂交仪 ７５ ℃变性 ５ ｍｉｎ，３７ ℃过夜杂交 １８ ～２０ ｈ。 杂交完成后，去除橡胶水泥，所有切片在 ０畅３ ×ＮＰ４０ ／０畅４ × ＳＳＣ 的常温溶液和 ７３ ℃溶液中分别浸洗 ５ ｍｉｎ 和 ２ ｍｉｎ，暗 处自然干燥玻片。 将 １０ μＬ ＤＡＰＩ 复染剂滴加于杂交区域，
二、结果 １．成功率：参考 ＦＩＳＨ 检测成功与失败的标准，实验组 ６０ 张切片与对照组 ３０ 张切片全部得到有效的荧光信号，结 果满意，成功率为 １００％。 对照组中，在选择 ＤＡＰＩ 滤光片 时，荧光显微镜下可见核膜完整，核染色深浅适中，核间隙分 辨清楚，选择 Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ 和 Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ 滤光片时， 可见红、绿荧光信号明亮清晰，背景较低。 实验组中，除了红 色背景较对照组略深外，其余效果与对照组相近。 红色背景 随免疫组织化学背景颜色的深浅而加深或减弱（图 １ ～６）。 ２．携 带 Ｃ－ｍｙｃ 断 裂 基 因 的 伯 基 特 淋 巴 瘤 和 携 带 ＩｇＨ ／ＣＣＮＤ１融合基因的套细胞淋巴瘤：实验组中，１０ 例伯基 特淋巴瘤和 １０ 例套细胞淋巴瘤的细胞膜 ／质和细胞核阴性 的切片中均分别观察到了异常断裂信号和异常融合信号，且 阳性细胞的比例与对照组一致。 ３．乳腺浸润性导管癌：实验组中，１０例乳腺浸润性导管
非特异棕黄色背景造成的。 所以我们 在选择实验组的切片时，尽量选择免疫 组织化学染色无背景或背景较淡的，不 选用背景过深的切片。
癌病例进行 ＨＥＲ２ 基因检测，５ 例有扩增，５ 例无扩增。 每一 例中免疫组织化学细胞膜 ／质阴性和细胞核阴性的切片，其 Ｒａｔｉｏ 值与对照片一致。
４畅切片完整性：实验组与对照组切片未出现脱片现象。 信号完整，定位准确。
仔细比较免疫组织化学和常规 ＦＩＳＨ 操作，我们不难看 出：这两种方法 都 需 要 打 开 甲 醛 液 固 定 组 织 产 生 的 蛋 白 交 联［６］ 。 只是对于免疫组织化学来说，采用高压或微波修复的 方法打开交联，是为了暴露抗原，利于抗原抗体结合，而对于 ＦＩＳＨ 来说，采用高压的方法打开交联，是为了增加探针的通 透性，利于探针与靶 ＤＮＡ 结合。 鉴于高压（在免疫组织化学
ＤＯＩ：１０畅３７６０ ／ｃｍａ畅ｊ畅ｉｓｓｎ畅０５２９－５８０７畅２０１４畅１１畅０１２ 作者单位：１０００５０ 首都医科大学附属北京友谊医院病理科 通信作者：周小鸽，Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｈｏｕｘｉａｏｇｅ５９＠ｈｏｔｍａｉｌ畅ｃｏｍ
立即盖上盖玻片。 暗处放置 １０ ～２０ ｍｉｎ 后，在荧光显微镜 下选用 ＤＡＰＩ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ 和 Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ 滤光片，分 别观察 ＤＡＰＩ、绿色和红色三种荧光信号。 实验组切片需要 先小心揭去盖玻片，二甲苯脱胶，梯度乙醇入水，１％盐酸乙 醇褪色 １０ ｍｉｎ，９６ ℃蒸馏水浴 ２０ ｍｉｎ，随之的胃蛋白酶消化 及后续步骤按本实验室常规的 ＦＩＳＨ 操作步骤进行。