蛋白质检测方法精品课件
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蛋白质分析鉴定精品课件
对于由两条及两条以上多肽链组成 的蛋白质分子，则需将其拆开（断 裂二硫键）并单独分离出来。
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22
2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
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31
双向电泳：
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
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32
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。
a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
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12
五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
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13
物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波
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45
双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的
非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。
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22
2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
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双向电泳：
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
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双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。
a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
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五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
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物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波
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双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的
非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。
双缩脲法测定蛋白质PPT演示课件
端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
•5
吸量管的使用注意事项
•9
光吸收示意图
I0
I
C
b
•10
吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
A＝KCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度 T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则A＝KC
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
•5
吸量管的使用注意事项
•9
光吸收示意图
I0
I
C
b
•10
吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
A＝KCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度 T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则A＝KC
《血清蛋白质测定》课件
血清蛋白质按功能可分为载体蛋白、凝血蛋白、补体系 统成分、免疫球蛋白和酶等。
血清蛋白质的功能
维持血浆渗透压
血清蛋白质能够维持血浆 渗透压，保持血液的正常 循环。
参与物质运输
血清蛋白质能够结合并运 输脂类、离子、药物等物 质，维持体内代谢平衡。
参与免疫调节
血清蛋白质如免疫球蛋白 ，能够参与机体免疫应答 ，抵御病原体入侵。
发展前景广阔，血清蛋白质测定将在临床实践中发挥更加重要的作用，为患者带来更好的诊 疗体验和治疗效果。同时，随着生物技术的不断发展，血清蛋白质组学的研究也将得到更加 深入的开展，有望为疾病的诊断和治疗提供更多的线索和思路。
THANKS
感谢观看
通过金属表面增强效应，提高拉曼散 射信号，实现对蛋白质的快速、高灵 敏度检测。
质谱技术
利用质谱仪对蛋白质进行定性和定量 分析，具有高灵敏度、高特异性的优 点。
血清蛋白质组学的研究进展
血清蛋白质组学是研究血清中蛋白质组成、表达 01 和功能的一门科学，对于疾病诊断和治疗具有重
要意义。
血清蛋白质组学研究涉及蛋白质分离、鉴定、定 02 量和功能分析等多个方面，需要综合运用多种技
肝病患者由于肝功能受损，蛋白质合成能力下降，导致 血清蛋白质水平降低。通过测定血清蛋白质水平，可以 评估肝病患者的病情严重程度和预后。
慢性肝炎、肝硬化、肝癌等肝病患者常伴有血清白蛋白 、前白蛋白等指标的降低，这些指标的变化有助于指导 临床治疗和评估治疗效果。
肾病患者的血清蛋白质测定
肾病患者由于肾脏滤过功能受损，蛋白质从尿中 丢失，导致血清蛋白质水平降低。通过测定血清 蛋白质水平，可以评估肾病患者的病情严重程度 和预后。
02 血清蛋白质测定在临床实践中广泛应用于多种疾 病，如感染、肿瘤、心血管疾病等，为医生提供 重要的参考信息。
血清蛋白质的功能
维持血浆渗透压
血清蛋白质能够维持血浆 渗透压，保持血液的正常 循环。
参与物质运输
血清蛋白质能够结合并运 输脂类、离子、药物等物 质，维持体内代谢平衡。
参与免疫调节
血清蛋白质如免疫球蛋白 ，能够参与机体免疫应答 ，抵御病原体入侵。
发展前景广阔，血清蛋白质测定将在临床实践中发挥更加重要的作用，为患者带来更好的诊 疗体验和治疗效果。同时，随着生物技术的不断发展，血清蛋白质组学的研究也将得到更加 深入的开展，有望为疾病的诊断和治疗提供更多的线索和思路。
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通过金属表面增强效应，提高拉曼散 射信号，实现对蛋白质的快速、高灵 敏度检测。
质谱技术
利用质谱仪对蛋白质进行定性和定量 分析，具有高灵敏度、高特异性的优 点。
血清蛋白质组学的研究进展
血清蛋白质组学是研究血清中蛋白质组成、表达 01 和功能的一门科学，对于疾病诊断和治疗具有重
要意义。
血清蛋白质组学研究涉及蛋白质分离、鉴定、定 02 量和功能分析等多个方面，需要综合运用多种技
肝病患者由于肝功能受损，蛋白质合成能力下降，导致 血清蛋白质水平降低。通过测定血清蛋白质水平，可以 评估肝病患者的病情严重程度和预后。
慢性肝炎、肝硬化、肝癌等肝病患者常伴有血清白蛋白 、前白蛋白等指标的降低，这些指标的变化有助于指导 临床治疗和评估治疗效果。
肾病患者的血清蛋白质测定
肾病患者由于肾脏滤过功能受损，蛋白质从尿中 丢失，导致血清蛋白质水平降低。通过测定血清 蛋白质水平，可以评估肾病患者的病情严重程度 和预后。
02 血清蛋白质测定在临床实践中广泛应用于多种疾 病，如感染、肿瘤、心血管疾病等，为医生提供 重要的参考信息。
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
蛋白质的研究方法优秀课件.ppt
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
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细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
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25
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蛋白质的研究方法优秀课件
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等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
大学课程蛋白质定量方法介绍、比活性介绍课件
一、蛋白质定量方法介绍
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lowry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） 二喹啉甲酸（BCA）比色法 紫外吸收法
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
双缩脲法 （Biuret法）
Folin-酚试剂法 （Lowry法）
三、Km测定
Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对 应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
Km的意义
Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度 Km可以反映酶与底物亲和力的大小 Km可用于判断反应级数 Km是酶的特征性常数 Km可用来判断酶的最适底物
Km测定方法
[S]/V=1/Vmax [S]+ Km/ Vmax
比色பைடு நூலகம் 标准曲线
考马斯亮蓝法
二喹啉甲酸
（Bradford法） （BCA）比色法
速度
灵敏度
免干扰
紫外吸收法
速度
灵敏度
免干扰
二、比活性
比活性是单位重量(mg)蛋白样品中所含酶的活性单位
随着酶的逐步纯化其比活性逐步升高，可借以鉴定酶 的纯化程度和纯化步骤的正确性
二、比活性
国际酶学委员会
1min内使 1μmol底物转 变所需的酶量
实验检测生物组织中的糖类脂肪和蛋白质ppt课件
２、安徽阜阳劣质奶粉事件震惊全国，引起
世人注目。鉴定脱脂淡奶粉是否为伪劣产品，
肯定不需要用到的化学试剂是(
B)
A.斐林试剂
B. 红墨水
C.双缩脲试剂
D.苏丹Ⅳ染液
为 深 入 学 习 习近平 新时代 中国特 色社会 主义思 想和党 的十九 大精神 ,贯彻全 国教育 大会精 神,充分 发挥中 小学图 书室育 人功能
2、配制斐林试剂：
→ 甲液
0.1g/mLNaOH
+
乙液 0.05g/mLCuSO4
2
为 深 入 学 习 习近平 新时代 中国特 色社会 主义思 想和党 的十九 大精神 ,贯彻全 国教育 大会精 神,充分 发挥中 小学图 书室育 人功能
3、材料用具：
如果植物组织中积累的成分是淀粉 和蔗糖，那就无法检测到还原性糖。 有些植物尽管含有较多的还原性糖， 但如果本身含有叶绿素或其他色素， 这些色素就会影响实验现象起到遮 盖作用。这些都不适宜做实验材料。
将量取的蛋清液和双缩脲试 剂A液分别倒入到试管中，震 荡均匀，此时可见试管内仍 然是透明的。
再向试管中加入4滴双缩脲 试剂B液。
为 深 入 学 习 习近平 新时代 中国特 色社会 主义思 想和党 的十九 大精神 ,贯彻全 国教育 大会精 神,充分 发挥中 小学图 书室育 人功能
震荡均匀，此时可见试管内溶液呈紫色，这就表明蛋清 液中含有蛋白质。
可看到溶液呈橘黄色，则 证明样液中含脂肪。
为 深 入 学 习 习近平 新时代 中国特 色社会 主义思 想和党 的十九 大精神 ,贯彻全 国教育 大会精 神,充分 发挥中 小学图 书室育 人功能
方法二：制作切片
实验材料
芝麻，脂肪含量丰富，但 种子颗粒太小，不利于切 片制作。 玉米，脂肪含量较少，种 子颗粒也较小，因此也不 适合做实验材料。
体液蛋白质检验(生物化学检验课件)
种类：1000种 500种 200种 含量： 60-80g/L 来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂
（一）血浆蛋白质的分类 1. 根据分离方法分类
盐析法：（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液） 分为清蛋白和球蛋白(最简单)
醋酸纤维素薄膜电泳：6种
分
电泳法 (实用)
琼脂糖凝胶电泳：13种 聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种
第七章
体液蛋白质检验
教学目标 OBJECTIVES
知识目标
✓ 简述血浆蛋白质的组成、功能及分类。 ✓ 认识血清总蛋白和、白蛋白、纤维蛋白原的测定方法和原理。 ✓ 归纳急性时相反应蛋白的概念、种类和临床意义。
能力目标
✓ 描述血浆中主要蛋白质的来源、功能和临床意义。 ✓ 描述常见相关疾病蛋白质水平的典型变化特征。
(六) α2-巨球蛋白(α2-MG，AMG)
合成部位：肝细胞和单核吞噬细胞系统合成 理化性质：分子量最大的蛋白质，625-800KD 生理功能：是血浆中主要的蛋白酶抑制剂，能与蛋白水解酶 （如纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶及组织蛋 白酶）结合而抑制这些酶的活性
临床意义 ①低蛋白血症（如肾病综合症）时升高，可能是一种代偿机制以 保持血浆胶体渗透压 ②妊娠及口服避孕药时升高 ③新生儿及儿童比成人高2-3倍，是保护作用，抗衡较高浓度的 蛋白酶
生理功能 ①急性时相反应主要蛋白：急性炎症时升高，与免疫防御功能 有关 ②可结合利多卡因和普萘洛尔（心得安），急性心肌梗死时 AAG作为急性时相反应升高，可干扰药物剂量的有效浓度
临床意义 ①作为急性时相反应指标：风湿病，恶性肿瘤，心肌梗死和组 织坏死时增高；一般增加3-4倍 ②随糖皮质激素而增加，包括内源性的Cushing综合征和外源 性强的松、地塞米松等药物治疗时；雌激素使其降低。 ③营养不良，肝严重损伤、肾病综合征、胃肠道疾病致蛋白严 重丢失等情况下AAG降低 ④AAG升高是活动性溃疡性结肠炎最可靠的诊断指标之一 参考范围：0.25-2.0g/L
（一）血浆蛋白质的分类 1. 根据分离方法分类
盐析法：（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液） 分为清蛋白和球蛋白(最简单)
醋酸纤维素薄膜电泳：6种
分
电泳法 (实用)
琼脂糖凝胶电泳：13种 聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种
第七章
体液蛋白质检验
教学目标 OBJECTIVES
知识目标
✓ 简述血浆蛋白质的组成、功能及分类。 ✓ 认识血清总蛋白和、白蛋白、纤维蛋白原的测定方法和原理。 ✓ 归纳急性时相反应蛋白的概念、种类和临床意义。
能力目标
✓ 描述血浆中主要蛋白质的来源、功能和临床意义。 ✓ 描述常见相关疾病蛋白质水平的典型变化特征。
(六) α2-巨球蛋白(α2-MG，AMG)
合成部位：肝细胞和单核吞噬细胞系统合成 理化性质：分子量最大的蛋白质，625-800KD 生理功能：是血浆中主要的蛋白酶抑制剂，能与蛋白水解酶 （如纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶及组织蛋 白酶）结合而抑制这些酶的活性
临床意义 ①低蛋白血症（如肾病综合症）时升高，可能是一种代偿机制以 保持血浆胶体渗透压 ②妊娠及口服避孕药时升高 ③新生儿及儿童比成人高2-3倍，是保护作用，抗衡较高浓度的 蛋白酶
生理功能 ①急性时相反应主要蛋白：急性炎症时升高，与免疫防御功能 有关 ②可结合利多卡因和普萘洛尔（心得安），急性心肌梗死时 AAG作为急性时相反应升高，可干扰药物剂量的有效浓度
临床意义 ①作为急性时相反应指标：风湿病，恶性肿瘤，心肌梗死和组 织坏死时增高；一般增加3-4倍 ②随糖皮质激素而增加，包括内源性的Cushing综合征和外源 性强的松、地塞米松等药物治疗时；雌激素使其降低。 ③营养不良，肝严重损伤、肾病综合征、胃肠道疾病致蛋白严 重丢失等情况下AAG降低 ④AAG升高是活动性溃疡性结肠炎最可靠的诊断指标之一 参考范围：0.25-2.0g/L
分光光度法检测蛋白质含量课件
蛋白质含量的计算方法
通过测量蛋白质溶液在特定波长下的 吸光度，利用标准曲线法或直接比较 法计算蛋白质含量。
标准曲线法需要制备不同浓度的蛋白 质标准溶液，绘制吸光度-浓度标准曲 线，根据待测样品的吸光度值在标准 曲线上找到对应的浓度。
蛋白质含量检测的影响因素
待测蛋白质的纯度和分子结构会影响其紫外吸收性质，从而影响检测结果的准确性 。
该方法具有高灵敏度、高准确度和高重现性 等优点。
分光光度法的原理
当一束特定波长的光通过含有待 测物质的溶液时，部分光会被吸
收。
吸收程度与物质浓度成正比，因 此可以通过测量透射光的强度来
计算物质浓度。
常用的分光光度计可以调整波长 范围，以便对不同物质进行测定
。
分光光度法的应用
在生物学和医学领域，分光光 度法常用于测定生物分子，如 蛋白质、核酸和酶的浓度。
03
准确称量样品
在称量样品时，应使用精 确天平，确保称量结果的 准确性。
正确设置仪器参数
在使用分光光度计时，应 根据实验要求正确设置仪 器参数，以确保测量结果 的准确性。
规范操作实验步骤
在实验过程中，应按照实 验步骤规范操作，避免因 操作不当导致实验结果误 差。
实验结果可靠性验证方法
重复实验
为了验证实验结果的可靠性，可 以重复进行实验，并对结果进行
在化学和环境科学领域，该方 法用于测定金属离子、有机化 合物和其他物质的浓度。
分光光度法还可以用于水质监 测、药物分析以及食品安全等 领域。
02
蛋白质含量检测原理
蛋白质的紫外吸收性质
01
蛋白质分子中的肽键和芳香氨基 酸在紫外光区有强烈的吸收峰， 其吸光度与蛋白质浓度成正比。
蛋白质分析课件
《蛋白质分析》PPT课件
蛋白质的快速测定－双缩脲法
原理
《蛋白质分析》PPT课件
方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品的测定。也可定量测定分离 纯化后的蛋白质。
《蛋白质分析》PPT课件
步骤
标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上 层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制 标准曲线。
《蛋白质分析》PPT课件
四、紫外吸收法
原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由 于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环 残基存在。由于存在于每一种食品的蛋 白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定， 所以可用比色法，即在280nm处比色测定 蛋白质的浓度。
《蛋白质分析》PPT课件
适用范围
应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于 许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故 还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量， 但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提 在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。 尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫 外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的 测定更困难。
蛋白质的快速测定－双缩脲法
原理
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方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品的测定。也可定量测定分离 纯化后的蛋白质。
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步骤
标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上 层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制 标准曲线。
《蛋白质分析》PPT课件
四、紫外吸收法
原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由 于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环 残基存在。由于存在于每一种食品的蛋 白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定， 所以可用比色法，即在280nm处比色测定 蛋白质的浓度。
《蛋白质分析》PPT课件
适用范围
应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于 许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故 还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量， 但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提 在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。 尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫 外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的 测定更困难。
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
蛋白质检测方法ppt课件
✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
15
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
18
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
4
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
7
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
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✓ 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋白质结合前 后基于其疏水空腔提供了一个非极性环境从而导致探 针荧光性质的改变
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✓ 基于蛋白质与有机染料结合作用
蛋白质与荧光染料结合后,能使溶液荧光强度增强或 淬灭,并且其变化量与蛋白质浓度成正比。有机染料包 括：血管黄素，曙红Y，铬天青S，溴酚蓝，四羧基苯基 卟啉，Evans blue，偶氮染料，方酸菁染料，酞菁染料等
✓ 优点：操作简单、测量速度快
✓ 缺点：灵敏度较差，精度不高
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比色法-Folin-酚试剂/Lowry法
✓ 原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中
的Cu2+形成络合物。
2、由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和
Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷
曙红Y
23
铬天青S
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溴酚蓝
Evans blue
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四羧基苯基卟啉
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偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
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✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转移
(photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选择
性识别
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✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
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比色法-BCA法
✓ 优点：稳定性好、显色灵敏度高，显色灵敏度与 Folin-酚法相当，且不受去垢剂、变性剂的影响
✓ 缺点：反应速度慢，易受糖类、尿素、B2 巯基乙醇等 物质的干扰，比Folin-酚法对糖类更加敏感
13
最理论基础：
1、考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，分为 G-250 和 R250 两种，是目前使用最为广泛的一种蛋白质染色剂。
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
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凯氏定氮法
理论基础：
1. 各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左 右。
2. 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸 铵收后中，的可NH由4+标与准N盐aO酸H滴反定应并又定可量转。变为NH3，用硼酸液吸
✓ 小分子无荧光,在蛋白质溶液中加入小分子后,蛋白质 的内源荧光淬灭
✓ 小分子有荧光,蛋白质与小分子作用后,内源荧光被淬 灭,而小分子的荧光被敏化增强
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✓ 基于蛋白质疏水作用：
✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性 残基包埋在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲 水和疏水平衡在蛋白质结构与功能方面起着关键作用。
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
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比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理
✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
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质谱法
✓ 原理：质谱分析法是将化合物形成母离子和碎片离子, 根据离子的质荷比(m/z)进行分离, 从而对化合物的成分 和结构进行分析的方法质谱分析的一般过程是: 样品由 合适的进样装置引入并进行气化, 气化后的样品进入离 子源后被电离, 电离后的离子经过适当加速后进入质量 分析器, 根据不同的 m/z 进行分离, 到达检测器, 产生不 同的信号, 利用专业的生物软件进行后续分析。
✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
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高效液相色谱法
原理：1、利用组分在两相中的热力学分配系数和动力学扩 散系数差异来实现混合组分分离
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近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
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蛋白质的检测方法
✓ 传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试 验
✓ 常规方法： 物理法：紫外吸收法 化学法：凯氏定氮法；比色法 ✓ 高效液相色谱法 ✓ 毛细管凝胶电泳法 ✓ 近红外光谱法 ✓ 质谱法 ✓ 荧光法
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免疫印迹法（ Western blot）
✓ 原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然 后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。 Western 杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的 检测方法 ✓ 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的 定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一 种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。
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比色法-茚三酮法
✓ 茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后与水分子结合形 成水合茚三酮，进而可与氨、一级胺、二级胺发生化学 反应生成紫蓝色或黄色缩合物。茚三酮法可用于水解蛋 白质的检测。
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比色法-茚三酮法
以氨基酸为例，首先在弱酸性加热条件下氨基酸与水合茚酸酮发生氧 化反应，氨基酸脱去氨基和羟基变成醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基并 脱去分水子变成胺合茚三酮。随后胺合茚三酮与茚三酮反应生成席夫碱， 并最终形成紫蓝色或黄、棕色化合物，产物颜色的深浅与蛋白质的浓度相 关，最大吸收波长为 570 nm 左右。
2、考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，吸收峰位 置为 488 nm 左右，容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰 残基结合，结合后颜色变为蓝色，最大吸收峰的位置 转移到 595nm。
✓ 优点：结合稳定、反应速度快、显色灵敏度高，操作 简便，不受酚类、游离氨基酸、络合剂等成分干扰
✓ 缺点：不同蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基的含量不 同，因此其与不同的蛋白质结合有强有弱，导致测量不 同的蛋白质时存在较大偏差
蛋白质检测研究进展
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Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
2
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蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具 有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的 自身独有特点与性质： 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸 反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α羧基反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，
其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于
定量分析。
✓ 优点：反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测量 ✓ 缺点：Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定因而要求精确控
制操作时间，且容易受去酚类、糖类、尿素等多种物质的干
扰。此外，而不同的蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，
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免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
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样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
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酶联免疫吸附试验
✓ 原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原 或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定 时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物， 根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小 进行定性或定量分析。
荧光法
✓ 荧光探针具有灵敏度高，选择性好，体积小，受生物 体内活性小分子及金属离子干扰小等优点
✓ 基于小分子荧光探针检测蛋白质
小分子与蛋白质相互作用后可引起小分子荧光光谱 和蛋白质自身荧光内源荧光光谱以及同步荧光光谱的变 化,如荧光强度和偏振度的改变、新荧光峰的出现等,这 些均可以提供小分子与蛋白质结合的信息。小分子与蛋 白质作用引起体系荧光性质改变有两种情况：
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✓ 基于蛋白质与有机染料结合作用
蛋白质与荧光染料结合后,能使溶液荧光强度增强或 淬灭,并且其变化量与蛋白质浓度成正比。有机染料包 括：血管黄素，曙红Y，铬天青S，溴酚蓝，四羧基苯基 卟啉，Evans blue，偶氮染料，方酸菁染料，酞菁染料等
✓ 优点：操作简单、测量速度快
✓ 缺点：灵敏度较差，精度不高
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比色法-Folin-酚试剂/Lowry法
✓ 原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中
的Cu2+形成络合物。
2、由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和
Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷
曙红Y
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铬天青S
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溴酚蓝
Evans blue
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四羧基苯基卟啉
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偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
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✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转移
(photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选择
性识别
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✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
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比色法-BCA法
✓ 优点：稳定性好、显色灵敏度高，显色灵敏度与 Folin-酚法相当，且不受去垢剂、变性剂的影响
✓ 缺点：反应速度慢，易受糖类、尿素、B2 巯基乙醇等 物质的干扰，比Folin-酚法对糖类更加敏感
13
最理论基础：
1、考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，分为 G-250 和 R250 两种，是目前使用最为广泛的一种蛋白质染色剂。
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
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凯氏定氮法
理论基础：
1. 各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左 右。
2. 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸 铵收后中，的可NH由4+标与准N盐aO酸H滴反定应并又定可量转。变为NH3，用硼酸液吸
✓ 小分子无荧光,在蛋白质溶液中加入小分子后,蛋白质 的内源荧光淬灭
✓ 小分子有荧光,蛋白质与小分子作用后,内源荧光被淬 灭,而小分子的荧光被敏化增强
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✓ 基于蛋白质疏水作用：
✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性 残基包埋在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲 水和疏水平衡在蛋白质结构与功能方面起着关键作用。
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
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比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理
✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
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质谱法
✓ 原理：质谱分析法是将化合物形成母离子和碎片离子, 根据离子的质荷比(m/z)进行分离, 从而对化合物的成分 和结构进行分析的方法质谱分析的一般过程是: 样品由 合适的进样装置引入并进行气化, 气化后的样品进入离 子源后被电离, 电离后的离子经过适当加速后进入质量 分析器, 根据不同的 m/z 进行分离, 到达检测器, 产生不 同的信号, 利用专业的生物软件进行后续分析。
✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
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高效液相色谱法
原理：1、利用组分在两相中的热力学分配系数和动力学扩 散系数差异来实现混合组分分离
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近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
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蛋白质的检测方法
✓ 传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试 验
✓ 常规方法： 物理法：紫外吸收法 化学法：凯氏定氮法；比色法 ✓ 高效液相色谱法 ✓ 毛细管凝胶电泳法 ✓ 近红外光谱法 ✓ 质谱法 ✓ 荧光法
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免疫印迹法（ Western blot）
✓ 原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然 后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。 Western 杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的 检测方法 ✓ 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的 定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一 种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。
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比色法-茚三酮法
✓ 茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后与水分子结合形 成水合茚三酮，进而可与氨、一级胺、二级胺发生化学 反应生成紫蓝色或黄色缩合物。茚三酮法可用于水解蛋 白质的检测。
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比色法-茚三酮法
以氨基酸为例，首先在弱酸性加热条件下氨基酸与水合茚酸酮发生氧 化反应，氨基酸脱去氨基和羟基变成醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基并 脱去分水子变成胺合茚三酮。随后胺合茚三酮与茚三酮反应生成席夫碱， 并最终形成紫蓝色或黄、棕色化合物，产物颜色的深浅与蛋白质的浓度相 关，最大吸收波长为 570 nm 左右。
2、考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，吸收峰位 置为 488 nm 左右，容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰 残基结合，结合后颜色变为蓝色，最大吸收峰的位置 转移到 595nm。
✓ 优点：结合稳定、反应速度快、显色灵敏度高，操作 简便，不受酚类、游离氨基酸、络合剂等成分干扰
✓ 缺点：不同蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基的含量不 同，因此其与不同的蛋白质结合有强有弱，导致测量不 同的蛋白质时存在较大偏差
蛋白质检测研究进展
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Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
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蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具 有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的 自身独有特点与性质： 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸 反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α羧基反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，
其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于
定量分析。
✓ 优点：反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测量 ✓ 缺点：Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定因而要求精确控
制操作时间，且容易受去酚类、糖类、尿素等多种物质的干
扰。此外，而不同的蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，
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免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
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样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
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酶联免疫吸附试验
✓ 原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原 或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定 时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物， 根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小 进行定性或定量分析。
荧光法
✓ 荧光探针具有灵敏度高，选择性好，体积小，受生物 体内活性小分子及金属离子干扰小等优点
✓ 基于小分子荧光探针检测蛋白质
小分子与蛋白质相互作用后可引起小分子荧光光谱 和蛋白质自身荧光内源荧光光谱以及同步荧光光谱的变 化,如荧光强度和偏振度的改变、新荧光峰的出现等,这 些均可以提供小分子与蛋白质结合的信息。小分子与蛋 白质作用引起体系荧光性质改变有两种情况：