抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些？

抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料就是腹水与细胞培养上清,而通常经过免疫制备

:

抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa

IgG 150 50,25

IgM 900 65,25

IgM单体180 65,25

硫酸铵沉淀法:

基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,就是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱与度在33~50%。

适用于:鼠抗所有亚类、其她种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA

基本操作:

1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清;

2、加入饱与硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白;

3、沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐;

4、过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0、02%叠氮钠)缓冲液洗脱;

5、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度;

6、抗体保存浓度在0、1-30 mg/mL适宜,-20 ℃保存不超过一个月,避免反复冻融。

亲与层析法

基本原理:基因工程改造的protein A与protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A与protein G结合到柱料上,通过亲与层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。

protein A的B结构域

protein A的各个结构域

protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段(尤其就是人的IgG1、IgG2、IgG4,豚鼠,猕猴,鼠类IgG2a、兔)以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主,表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要就是为了增加与多孔性材料的偶联性能,也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域,另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。

protein G分离自G Streptococcus的细胞壁,分子量65 kDa,由spg基因编码,可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域,其结合力较protein A更强。

protein G的B结构域

protein G的各个结构域

还有一种protein A/G蛋白,就是基因工程改造产物,就是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性,能结合人与鼠的IgG所有亚型,不结合鼠的IgA、IgM。

①protein A亲与层析

适用于:人(IgG3除外)、兔、豚鼠、猪的抗体;

基本操作:

1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清;

2、调节pH到8、0:腹水以10倍体积pH8、0 PBS稀释、培养上清用pH8、0 PBS透析或强氧化钠调节;

3、过protein A琼脂糖凝胶柱,pH8、0 PBS洗杂;

4、柠檬酸缓冲液洗脱抗体(小鼠IgG1用pH6、5,IgG2a用pH4、5,IgG2b与IgG3用pH3、0),并注意收集管内需加入Tris缓冲液中与滴下的抗体溶液;

5、用PBS透析;

6、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度。

②protein G亲与层析

与protein A相比,protein G通常情况下在低pH环境下与抗体结合力较强,不过高pH环境下小鼠IgG1与兔、人的抗体在仍可以与protein G结合。

适用于:小鼠IgG1、大鼠抗体、猴抗体、兔抗体、牛抗体、山羊抗体、马抗体、绵羊抗体; 基本操作:

1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清;

2、调节pH到5、0:腹水以10倍体积0、1 M醋酸钠(pH5、0)稀释、培养上清以2倍体积0、1 M醋酸钠(pH5、0)稀释;

3、过protein G柱,0、1 M醋酸钠(pH5、0)洗杂;

4、0、1 M甘氨酸(pH2、8)洗脱抗体,并注意收集管内需加入Tris缓冲液中与滴下的抗体溶液

5、用PBS透析;

6、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度。

③抗原亲与层析法

抗原亲与纯化一般用在多抗的纯化上,这种纯化方式去掉了血清中那些非特异性结合的抗体分子,得到的抗体分子基本上都就是能特异性与抗原结合的。抗原亲与纯化需要先将抗原偶联到柱料上,然后通过亲与层析的方式去除非特异性抗体及杂蛋白,得到特异性抗体。通常采用的柱料为溴化氢预处理与N-羟基琥珀酰亚胺预处理琼脂糖凝胶柱料,前者适合偶联大分子,后者适合偶联小分子物质,在实际操作中还就是需要根据情况进行选择。

适用于:多抗抗体的纯化,对抗体亚型无限制

偶联基本操作:

1、抗原用0、1 M NaHCO3偶联缓冲液(含0、5 M NaCl,pH8、3)溶解;

2、用1 mM稀盐酸洗涤柱料;

3、混合抗原与柱料,在室温混悬1 h或者4 ℃混悬过夜;

4、用偶联缓冲液洗涤偶联的柱料去掉未偶联抗原;

5、用0、1 M Tris(pH8、0)或1 M乙醇胺(pH8、0)处理偶联柱料2 h以封闭未偶联位点;

6、依次用0、1 M醋酸钠缓冲液(含0、5 M NaCl,pH4、0)与0、1 M Tris(含0、5 M NaCl,pH8、0)洗涤偶联柱料五次,重复此操作三遍。

纯化基本操作:

1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清;

2、0、01 M PBS(pH7、4)平衡偶联柱料;

3、抗体样品过柱,0、01 M PBS(pH7、4)洗杂;

4、抗体洗脱液洗脱抗体;

5、用0、01 M PBS(pH7、4)透析;

6、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度。

随着技术的发展抗体的纯化方法越来越多,例如分子筛层析、离子交换层析等技术也被用于抗体的纯化,在实际运用中需要根据实验目的及其她因素进行方法的选择。