生化实验三-

四 注意事项
• 进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因
为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反 应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加 到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀， 以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反
应即能发生。
• 着重讲述分光光度计的使用。
五 实验报告格式
(三)分光光度计 1 原理
单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该 物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如 下式： A=-log(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 为吸收度； I。为入射的单色光强度；
I 为透射的单色光强度；T 为物质的透射比； k 为吸收系数；L 为被分析物质的光程； c 为物质的浓度
7. 将比色杆拉至2档，按下“调100%”键，仪器显示“100.0”完成调百。
8. 按下功能键，切换至吸光度模式，继续将比色杆拉至3档，读出仪器 显示的数字。
使用方法视频
三 实验方法
上表中第一项1-7号管为标准酪蛋白溶液，8-9号管为层析样品溶液。各管立即摇
匀，在室温下放置15min, 以1号管为对照管，于500nm处比色。记下1-7管吸光度， 做吸光度-酪蛋白浓度曲线。对8-9号管，选取落在标准曲线范围内的样品蛋白稀释 度，从标准曲线上查出其样品蛋白的浓度。
的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸 残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由 465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度
成正比。
• 本方法目前灵敏度较高,应用广泛。
4 紫外吸收法（UV spectrophotometry）
• 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基
连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。干扰这一测定的物质主要有
硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 • 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰
物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此此法常用于需要快速，但并不
需要十分精确的蛋白质测定。
3 考马斯亮兰法（Bradford法）
• 考马斯亮兰G-250在酸性溶液中主要是与蛋白质中
的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光
的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光
密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶
液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用
一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓
度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
5 BCA比色法（Bicinchoninine acid assay）
围内，蓝色深度与蛋白的浓度成正比。
2 本法的优缺点
• 优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。 • 缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不
是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双
缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而 且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、 Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 • 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
1 凯氏定氮法（Kjeldahl determination）
• 样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸 作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸 液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸 为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (2) (3)
• 在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试 剂（4，4´-二羧酸-2，2´-二喹啉钠）生成紫色复 合物，于562nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓
度成正比。
• 此法是一种较新的、高敏感度的蛋白测试法,其优
点是单一试剂、终产物稳定，几乎无干扰物质的
影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），
3 Procedures ⑴ Draw standard curve (Page 17 Fig. 1) ⑵ Determine concentration of sample solution (Page 17 Fig. 3) 4 Results 5 Attentions ⑴It must be shaken up immediately while Folin -phenol reagen B is added into the reaction mix. ⑵ Spectroscope must be operated smoothly.
• 6.Discussion • 7.Question
2 使用方法
1. 打开仪器开关，预热20分钟。
2. 用“波长没置”旋钮调整测试波长。 3 . 打开样品盖，将遮光体置入样品架中的第一格。
4. 取一支比色杯，加入作为空白对照的溶液，将上述比色杯放入样品架
的第二格。 5. 取另一个比色杯，加入待测溶液，并将其放入样品架的第三格，关上
样品盖。
6. 按动功能键，切换至透射比模式，拉动比色杆至1档，再按下“调0%” 键，仪器显示“-.000”。
Section 3 Quantitation of Casein ——— Folin-phenol Reagent Method (Lowry Method)
Abstract and key words
1 Purpose ⑴ study the principle and method to quantitate protein. ⑵ Master spectroscopic method ulteriorly.
2 Principle • Reagent A is equal to biuret reagent and reagent B is deoxidized easily by phenolic groups from tyrosine residues f protein or polypepti de, which brings out bule product. • The relationship between absorbance and pr otein concentration is a straight line in a defi nite range.
实验三 酪蛋白含量测定 ——Folin-酚试剂法(Lowry法)
一 目的要求
• 学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理 和方法。 • 进一步掌握分光光度法。
二 实验原理
（一） 蛋白质定量检测方法 • 凯氏定氮法（Kjeldahl determination） • 双缩脲法（Biuret method） • Folin－酚试剂法（ Folin-phenol Reagent Method ） • 紫外吸收法（UV spectrophotometry） • 考马斯亮蓝法（ Coomassie brilliant blue staining ） • BCA法（Bicinchoninine acid assay）
应用更加灵活。
（二） Folin—酚试剂法
1 原理
• 两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白
质中的肽键与铜结合生成复合物，使蛋白质的空间结构被
破坏，肽链转变为无规则松散状态，暴露大量的酪氨酸和 苯丙氨酸残基，增强了试剂乙反应的灵敏度。Folin—酚试 剂乙中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸残基还 原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定浓度范
• 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量。 如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25。
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2 双缩脲法（Biuret method）
• 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色 络合物，称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正 比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 • 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相