黑曲霉生产糖化酶及酶活测定_单海艳

第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 2010

92 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03

黑曲霉生产糖化酶及酶活测定

单 海 艳

（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）

摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。

关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言

（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位

黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。

2．黑曲霉形态、生理、生态特性

孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。

3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。

（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位

糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。 2．糖化酶的性质

糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％。

（1）糖化酶中糖和蛋白组成

糖化酶是一种糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊意义。

（2）糖化酶组分多型性

真菌产生的糖化酶组分多型性是常见的，市售的糖化酶中可分离出葡萄糖酶І和葡萄糖酶И两种组分。而市售黑曲霉生产的糖化酶曾分离出六种活性组分，每种均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖。这六种组分的分子量，沉淀系数，化学组分，等电点，酶的动力学及其它性质各异。培养基成分和的生产条件对糖化酶组分多型性也有影响，天然糖化酶在微生物培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而成多型性的酶类。

（3）糖化酶的热稳性

工业用的糖化酶都是利用它的热稳性，α-环状糊精可提高糖化酶的热稳性，最适温度范围一般为50℃～60℃。

（4）从酶PH 稳定性上看： 糖化酶具较宽的PH 值适应范围，但最适PH 为4-5。

（5）Ca 离子与酶结合后可使结构变得松散些，更有利于催化反应。

（6）糖化酶与底物亲和性

收稿日期：2009-11-26

作者简介：单海艳（1977—），女，牡丹江大学化工系讲师，研究方向：生物教学。

DOI:10.15907/ki.23-1450.2010.07.036

糖化酶是将麦芽糖糊精转化为D-葡萄糖，底物水解速度主要受底物分子的大小及结构影响。同时也受水解碳链序列中F一个键的影响，碳链越来越大。其最大反应速度随底物碳链的增长而增加，呈线性变化。

3．糖化酶的用途

主要用途是作淀粉糖化剂。在食品工业制造葡萄糖、麦芽糖、糊精糖浆和直链淀粉薄膜，改善面色质地，加工蔬菜、制造菜汁、菜泥。在发酵工业方面与α-淀粉一起还广泛用在谷氨酸、柠檬酸发酵生产中，作为淀粉原料，代替了麦芽和液体，提高了淀粉利用率。在我国，糖化酶还用于处理原理，水解棉中的低聚糖，减少棉纤维的粘缠以利于纺纱。

二、材料与方法

（一）材料：菌种：黑曲霉

仪器：恒温培养箱 离心机 水浴锅恒温液体振荡培养器小型液体发酵罐分光光度计等

试剂：链霉素 0.1%苯甲酸钠乳酸氢氧化钠硫酸铵等

（二）方法

液体深层发酵

工艺流程：试管斜面菌种→种子扩大培养→液体深层通风发酵→过滤→离心→干燥→粗酶制剂→酶活测定

配方：斜面种子培养基：蔗糖30g 硫酸铵3g 磷酸氢钾1g 硫酸镁0.5g 硫酸铁0.01g 水 1000 ml 琼脂2% 液体摇瓶扩大培养基：玉米面4％，豆饼粉3％

麦麸1% Kcl 0.5g 水1000ml自然PH通风

恒温液体深层通风发酵培养基：玉米粉10% 豆饼粉4%麦麸1%水1000ml PH 4.5

1．粗酶提取

发酵液→过滤→盐析→固形物→烘干→加入淀粉添充剂→磨粉→粗酶制剂。

2．酶活力测定

酶活力测定方法

（一）钢圈法：5ml3%琼脂倒皿 →再加5ml 可溶性淀粉与3% 琼脂→放入三个灭过菌的钢圈 分别滴入不同浓度的酶液→定期测定透明圈直径。

（二）比色法：10ml 20%可溶性淀粉 5ml柠檬酸 PH4.8（对照不加酶液，处理加1ml） 加1ml 10%NaOH终止反应，对照补加1ml酶液→滤纸过渡→比色。

三、结果与讨论

（一）结果

1．钢圈实验结果如下表：

糖化酶钢圈测试

时间 编号 1cm 2cm 3cm 平均值

23日8：101号（原液） 1.365 1.365 1.340 1.357

23日8：102号（稀释1倍） 1.320 1.290 1.270 1.290

23日8：103号（稀释2倍） 1.170 1.165 1.165 1.167

23日11：101号（原液） 1.4555 1.475 1.475 1.463

23日11：102号（稀释1倍） 1.340 1.380 1.380 10355

23日11：103号（稀释2倍） 1.315 1.365 1.325 1.335

23日16：001号（原液） 1.460 1.525 1.500 1.495

23日16：002号（稀释1倍） 1.365 1.370 1.385 1.373

23日16：003号（稀释2倍） 1.220 1.26.0 1.255 1.245

24日8：301号（原液） 1.760 1.765 1.760 1.762

24日8：302号（稀释1倍） 1.375 1.470 1.400 1.412

24日8：303号（稀释2倍） 1.300 1.350 1.325 1.326

2．DNS测定结果如下表

糖化酶酶活测定

反应时间含糖酶解产糖 CK 处理 CK 处理比色反应 Ehr 10 min 0.094 0.25 0.480 1.219 0.738 8.368 50.21 30min 0.041 0.338 0.229 1.635 1.406 23.89 47.79 平 均49

（二）分析

本实验得到酶活性一般，分析原因如下：

1．发酵当中，基质粘度过大，菌丝发生球结，这是通气不足的原因，因通气不足，氧的含量较低，造成代谢不彻底，有机酸积累，PH始终降低，正常发酵，应是PH先下降然后开始回升，结束发酵。

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