研究生考试资料分子生物学文献题整理

基因组学&蛋白质学文献交流1.研究相互作用蛋白质组学的意义？蛋白质之间的相互作用对于大多数细胞功能的发挥是必不可少的。

基因转运，细胞周期调控，信号转导和调控等基本过程都有赖于蛋白质复合物正常功能的行使。

蛋白质复合物组成的信号或串联混乱常导致细胞功能障碍，最终引起疾病。

相互作用蛋白质组学是指大范围地或在整体水平上研究蛋白质相互作用的一门新兴学科。

它侧重于研究蛋白质间的相互作用，试图建立细胞整体以及疾病或信号通路特异性的蛋白质相互作用网络。

主要有特殊药物反应的蛋白相互作用和依赖磷酸化或其他蛋白修饰的蛋白相互作用。

研究相互作用蛋白质组学已成为现代分子生物学研究的关键，研究复杂的蛋白质组成让我们了解到他们的分子功能，有助于我们进一步了解致病机制，研发药靶蛋白,更好地用药等。

蛋白质几乎很少能单独发挥其作用，多蛋白质复合物在生物功能行使中发挥着重要的作用.蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。

通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。

深入理解蛋白质之间的相互作用对于理解疾病的病理生理学及确定药物作用的靶点有重要作用。

对未来基础医学，临床医学，药物开发都有不可估量的作用。

蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益，蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。

2.相互作用蛋白质组学的研究方法有哪些?分析相互作用的蛋白质组学的方法主要是遗传方法和生物化学方法。

生物化学方法，通过直接与蛋白质作用来检测蛋白质复合物的组成，从而来探究蛋白之间的相互作用，如1免疫共沉淀作用2亲和提纯法33）串联亲和纯化方法等；遗传方法是在重组相互作用的报道分子的基础上确定蛋白质间的相互作用。

其中经典的膜酵母双杂交系统以成为个体蛋白质相互作用和全球蛋白质图谱分析中应用最广泛的方法。

文献中主要介绍了以下的方法1）蛋白质片段互补分析（PCA)2）膜酵母双杂交（MYTH)系统3）共振能量转移(RET)系统4）基于荧光的哺乳动物的蛋白质相互作用组图谱（LUMIER）5）哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱（MAPPIT）及其改良技术6）噬菌体展示技术7）蛋白质微阵列技术3.与传统蛋白质相互作用研究方法相比，相互作用蛋白质组学的优势在哪里？经典的酵母双杂交系统（Y2H）有其局限性：相互作用限制于细胞核内，并只能将酵母作为宿主系统。

很难用于高通量模式。

1、蛋白质片段互补分析（PCA）：它可用于高通量和低通量模式，不仅在体内、体内，在任何类型的细胞内都具有可操作性，也允许自然条件下和适当的亚细胞结构内进行试验，其适用范围广，性质较稳定。

2、膜酵母双杂交系统(MYTH):不需要在核内作用，并可用于高低通量从不同的组织鉴别相互作用的膜或膜相关蛋白不同功能、结构和亚细胞位置。

3、共振能量转移系统（PET）：一种典型的、高效的在体无损成像技术，能动态地反映活细胞生理过程的时空变化以及细胞信号转导通路的时空传递特性，可以在活细胞正常生理条件下无损伤地研究蛋白质间相互作用；可以反应在生物体内实时的研究动态的相互作用过程。

4、基于荧光的哺乳动物相互作用（LUMIER）：可应用于96孔板的自动检测，能扩大蛋白质间微弱的或短暂的作用，这种方法对于分析膜蛋白，表达量低的蛋白，或者比较大，多聚体的蛋白十分有效;5、哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用(MAPPIT）：可以在很多方面应用，可被用来筛选cDNA文库，可以用来鉴别小分子之间的相互作用，是药物开发和靶向分子分析的有利工具。

6、噬菌体展示技术：能够将表达蛋白和编码基因完美地联系起来, 并具有高通量、高选择性的特点，是确定和优化多肽功能的有效的方法7、蛋白质微阵列技术：可同时对成千上万的蛋白质的活性、功能、相互作用进行分析，且使检测系统小型化，缩短了检测时间，提高了敏感性，使成本效益大大降低。

*介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理蛋白质学研究中需要两条互补的实验工作流程—基于凝胶的工作流程和基于液相色谱的工作流程，基于凝胶的工作流程是目前使用较为广泛的、发展最为成熟的工作流程，通过样品制备、双向电泳分离、图像获取、图像分析，到抠点、酶切、点靶和MALDI-TOF蛋白鉴定等一整套技术手段，获得蛋白质数据。

而基于液相色谱的工作流程则可以对在双向电泳中难以分离鉴定的高相对分子质量、低相对分子质量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白质进行有效的分离鉴定。

双向电泳原理：第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH 梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离基因工程1、已分离出1株具有较高ACC脱氨酶活性的菌株，如何进一步对其ACC脱氨酶基因进行鉴定？1.基因测定（1）直接测定：根据ACC脱氨酶基因制作其DNA分子探针，进行核酸分子杂交；（2）PCR法：查阅资料，找出ACC脱氨酶的基因保守序列，设计出一对特异性引物，PCR 之后跑电泳，观察有没有条带产生；2.mRNA测定：根据ACC脱氨酶基因组成得出其转录的mRNA组成，利用探针检测；3.蛋白测定：采用免疫化学法导入蛋白抗体检测ACC脱氨酶。

1、利用分子克隆技术：提取出该细菌的基因，用限制酶切割获得ACC脱氨酶基因，与相应的载体拼接成重组体，然后转入受体菌中，最后筛选出有ACC脱氨酶功能的细菌。

2、利用DNA探针：制备与表达ACC脱氨酶基因相对应的DNA探针，然后利用核酸分子杂交技术，从而检测出该菌株是否携带有ACC脱氨酶基因。

3、利用mRNA测定：可根据ACC 脱氨酶基因组成得出其转录相应的mRNA组成，然后利用已知探针检测，从而鉴定ACC脱氨酶基因；或者将其逆转录得到相应DNA，再用分子克隆或者核酸分子杂交技术鉴定ACC 脱氨酶基因，可结合PCR技术。

4、利用蛋白质分子测定：可应用PCR技术先测出ACC 脱氨酶基因表达的蛋白质，再推测出ACC脱氨酶基因。

5、利用基因敲除：将ACC脱氨酶相应的基因敲除，然后观察其后ACC脱氨酶的表达情况2、高ACC脱氨酶活性菌能提高植物对重金属的抗性，如何从基因表达水平对这一问题进行研究？在重金属污染的土壤中，大多数植物会因为体内合成大量乙烯而生长受到抑制，并且植物细胞内会出现严重缺铁现象。

产ACC脱氨酶的细菌可以避免这一现象发生，因此我们通过以下方式在基因表达水平上进行研究：将ACC脱氨酶阴性、长势相同的植物分成数目相同的A、B、C三组，置于相同的重金属环境中，严格控制外部条件。

A组：将A组植物加入高ACC脱氨酶活性菌；B组：将高ACC脱氨酶活性菌利用基因敲除手段除去ACC脱氨酶的基因后加入到B组植物中；C组：不做处理，作为空白对照。

然后观察三种植物生长状况。

每隔一定时间，检测植物根部及嫩叶中乙烯含量，观察对比各组植物的生长状况，同时记录各组培养液中重金属浓度的改变情况，最后对比各组实验结果。

若A组植物生长比BC组好很多，则证明高ACC脱氨酶活性菌能提高植物对重金属的抗性。

在基因表达水平，ACC脱氨酶调节（AcdR）基因编码的亮氨酸应答调节蛋白（LRP）在缺氧的情况下和AcdB与FNR结合，在有氧的情况下和AcdB与CRP结合，从而引起ACC脱氨酶结构（AcdS）基因的转录，翻译出ACC脱氨酶。

而翻译出ACC脱氨酶可以将ACC分解为α- KB和氨水,这样就阻断了ACC合成乙烯的途径，降低了植物体内乙烯的含量，减少其对植物的危害根据这一原理，可以将不含ACC脱氨酶的植物分成三组，一组中导入ACC脱氨酶，一组不导入ACC脱氨酶然后，分别在这2组中加入重金属离子。

导入ACC脱氨酶的生长不受抑制，而未导入ACC脱氨酶组的生长受到抑制。

#ACC转氨酶降低乙烯高峰细菌合成并分泌IAA（吲哚乙酸），其与内源性IAA刺激细胞分裂增殖，细胞伸长并促进ACC合成酶的转录从而催化ACC合成。

ACC在ACC氧化酶的作用下产生乙烯从而对植物产生有害作用。

ACC转氨酶可以分解ACC为氨气和酮丁酸，减少乙烯的生成，从而减少对植物生长的抑制。

乙烯既可减少又可加剧病原菌的感染，它的分泌有两个高峰。

而关于ACC转氨酶选择性降低乙烯是影响他的第二个高峰而非第一个。

是因为stress存在时，ACC及ACC转氨酶含量很少，随后出现ACC氧化酶的增加，导致乙烯出现第一个高峰，仅仅是对植物所作的防御反应。

经过一段时间后，伴随着ACC合成酶及ACC的增多，ACC转氨酶出现，从而降低了第二个乙烯高峰。

生物分子的分离纯化1、什么是TAP法，它的基本原理是什么及其主要应用？TAP法，即串联亲和纯化法，通过嵌入一段蛋白质标记（TAP Tag），在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记，经过两步特异性的亲和纯化，在接近真实的生理条件下与目标蛋白质真实作用的蛋白质便可一起被洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术等方法鉴定。

蛋白质标记主要由蛋白A的IgG结合区（ProA)、钙调蛋白结合区(CBP)和中间被一个TEV蛋白酶识别的酶切位点隔开。

当蛋白标记在目标蛋白两端时，这两段结合区的顺序有所不同，但始终保证蛋白A的IgG结合区在外端。

基本原理：将Tag的基因片段导入目标蛋白编码基因的特定部位，然后导入宿主细胞或生物体，在生理条件或接近生理条件下表达融合蛋白复合物，通过两个特异性的亲和纯化/洗脱过程，即①将细胞裂解液通过IgG亲和柱，ProtA结合域与IgG结合，接着用含TEV蛋白酶的洗脱液清洗亲和柱，就可将蛋白质复合体清洗下来；②将洗脱下来的蛋白质复合体与偶联有钙调素的亲和柱混合，在钙离子的参与下，CBP结合域与钙调蛋白结合，再用比较温和的洗脱条件（含有EGTA洗脱液）洗脱，进一步除去杂质蛋白，得到纯净的蛋白质复合物。

主要应用有：(1)鉴定与目标蛋白相互反应的蛋白质及其反应模式，包括纯化与细胞功能（前体mRNA的剪接、RNA的转运和降解、蛋白质的修饰等）有关的蛋白质复合物，通过分析纯化的野生型及突变型蛋白质复合物来研究突变对蛋白质的影响，鉴定与目标蛋白直接或间接作用的配体（如核苷酸、脂质、肽等）。

（2）分析纯化的蛋白复合物的结构并研究其生物活性；（3）纯化在酵母、细菌等生物体内低度表达的重组蛋白，尤其在酵母蛋白质学中有成功的应用。

2、与传统分离纯化方法比较它有哪些优缺点？优点：传统的研究蛋白质相互作用的技术相比，TAP采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性，具有周期短、假阳性结果少等优点.通过这种方法鉴定出的蛋白质相互作用能真实地反映细胞中蛋白质分子之间的联系，蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平。