亲和分离技术
1简述亲和色谱分离技术的基本原理
1简述亲和色谱分离技术的基本原理？
答：亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
亲和色谱的固定相是键和亲和配基的亲和吸附介质。
由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度选择性，因此，亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端方法。
一般亲和色谱分离操作过程分： 1进料 2杂志清洗 3目标产物脱洗 4色谱柱再生。
2、举例简述亲和色谱分离蛋白的流程？
因为：三嗪类色素配基的特点是化学稳定性高，价格便宜，适应性广，亲和力适中，蛋白质结合容量大，因此，色素亲和色谱的操作成本低廉，有很高的实用价值。
答：以色素亲和色谱纯化脱氢酶为例：
1 加入3L菌体细胞抽提液；
2 用低溶度盐溶液A清洗，除去未被吸附的杂蛋白；
3 逐次到溶度盐溶液B和辅酶I溶液C洗脱，分别获得了羟基酪酸脱氢酶（3-HDH）和苹果酸脱氢酶（MHM）活性峰；
4 收集的3-HDH活性部分超滤浓缩至200ml后透析脱盐；
5 加入到另一个色素亲和柱，继续进行纯化；
6 经过两步色素亲和色谱纯化，3-HDH比活提高213倍（第一步34.4倍，第二部6.2倍）最终收率为78%。
A---10mmol/L磷酸盐缓冲液，PH=7.5(5L)
B----A液+1.0mmol/LKCl，PH=7.5(5L)
C----B液+2mmol/L NADH, PH=7.5(3L)。
第五章 亲和层析分离技术
遮盖，反而使亲和柱吸附力降低。
• 配体浓度太高又会使吸附力太强，造成洗脱困难； • 随着配体浓度的增加，非专一性吸附也增加，而专 一性吸附却降低。 • 理想的配基浓度为1-10µ mol/L；2µ mol/L的凝胶为
最好。
（三）配体偶联的位置
• 在一般情况下，亲和结 合时配体分子与待分离 物质仅有一部分发生相 互作用。 • 为了保证亲和吸附剂有 足够大的亲和能力，我 们希望配体固定化时， 其不参与亲和结合的部 位与载体进行偶联。
抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应
条件。 • 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性 吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 • 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass的商品都已 事先连接了氨烷基(烷基胺)。 • 用葡聚糖包被玻璃珠则可改善其亲水性，并增加化学活性基 团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在 DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。
二、间隔臂分子（手臂）
• 空间位阻效应 ：待分离生物大分子由于受到基质的空间
障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体。
• 解决的办法是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔 壁”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的
骨架向外扩展伸长。
O gel O OH C
NH + NH2(CH2)nNH2
配体Ligand: 亲和层析中能被某一生物大分
子识别和可逆结合的生物专一性物质。即
被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体): 亲和层析中与配体共价
结合,使其固相化的物质。
亲和吸附剂：配体和基质是共价结合的，
构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
现代分离技术-亲和层析
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七、亲和层析的应用
1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质
结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理
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酶与底物 (包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子)，抗原与抗体，激素与受体，核酸中的 互补链多糖与蛋白复合体。
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对载体的要求
不溶于水，但高度亲水； 惰性物质，非特异性吸附少； 具有相当量的化学基团可供活化； 理化性质稳定； 机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定
的流速； 通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子
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优缺点
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱 过程简单、快速，是一种理想的有效分离 纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高 选择性高活性回收率和高纯度等特点。
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但是亲和层析技术也有一些缺点主要是载 体 (如琼脂糖Sepharose) 价格昂贵机械强 度低 (易压床)配基的制备困难偶联条件激 烈需要使用剧毒的活化剂 (如CNBr)等。
抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和 力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来 说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间。
配体必须有一个适当的化学基团，这个基团不 参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接 支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分 子结合的亲和性。
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适用范围
生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、 抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及 多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等) 的分离和纯化
现代分离技术 -----亲和层析
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概念
亲和膜分离
亲和膜分离08生物工程（2）班0802012008 盛蕾摘要：随着生物工程和生命科学的迅速发展，其对生物大分子纯化的要求越来越苛刻，为获得高纯度、高质量、低成本的产物的产品，亲和膜分离技术出现了。
本文主要介绍了亲和膜的概念、分离原理、制备和亲和膜的应用及展望。
关键词：亲和膜；分离原理；制备；应用1 亲和膜分离概念1.1膜分离技术膜分离技术是用半透膜作为选择障层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，从而达到分离目的的技术。
它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能量等优点，已作为一种单元操作日益受到人们极大重视。
1.2亲和分离技术亲和层析是将欲分离物质的亲和配基通过一“手臂”连接于亲水性珠状载体上装于层析柱，溶液中只有能与配基结合的目标产物被吸附，而所有其他操作则直接流出，用适当的洗脱剂洗脱，使配基与目标产物的复合物解离而释放出目标产物。
亲和层析优点在于简单、快速、特异性强、回收率和纯化倍数高。
1.3亲和膜分离技术亲和膜分离技术是将膜分离和层析技术的结合起来的一项技术，有两者结合的亲和膜分离技术，可发挥两者的特色，具有处理量大、选择性强、易于放大等显著优点。
2 亲和膜分离原理亲和膜是亲和层析及膜分离的结合，亲和膜过程所采用的设备和膜分离所用的类似，也是在膜组件如中空纤维组件、平板式组件中进行，而其操作过程又类似于亲和层析：将样品混合物缓缓地流过膜，使其中与亲和配基有特异性相互作用的分子与配基产生偶合，生成相应的配合物，然后再通过改变条件，如洗涤液组成、pH、离子强度、温度等，使已和配基产生相互作用的配合物分子解离，将其收集起来，再将膜进行洗涤，再生成平衡，以备下次使用。
3亲和膜制备3.1膜材料的选择要实现在膜上的亲和分离，要解决一下几个关键问题：①膜表面要有足够多可利用的化学基团，使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基；②要有足够高的表面积，以便获得足够数量可利用的基团，并有足够大的孔径，以便能让生物大分子自由出入；③孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能；④在许多情况下，为了实现快速分离，一般要加压操作，因此要求膜要有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形；⑤亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度盐的缓冲液和有机溶剂。
亲和层析分离原理
亲和层析分离原理嗨，朋友们！今天咱们来聊聊一个超有趣的东西——亲和层析分离原理。
这可不是什么枯燥的科学术语，听我慢慢道来，保准你会觉得像听故事一样好玩。
想象一下，你在一个超级大的聚会里，人来人往，形形色色。
这里面呢，有一些人是特别要好的朋友，他们之间就像磁铁一样，一见面就紧紧吸引在一起。
亲和层析就有点像这个聚会里找好朋友的过程。
亲和层析里有个关键的东西叫亲和层析介质。
这就好比是聚会的场地，它可是很有讲究的。
这个介质就像是一个个有特殊功能的小房间，每个小房间都有自己独特的“性格”或者说特性。
比如说，有些小房间对某种特定的蛋白质特别有吸引力，就像有些场地专门是为某类人群举办活动的。
那我们要分离的东西呢，就像那些来参加聚会的人。
比如说我们要分离一种特殊的酶。
这种酶就像是一个有特殊身份标识的客人。
在亲和层析这个“大聚会”里，我们的酶客人有着它独特的标签，就像它穿着一件独一无二的衣服。
而我们的亲和层析介质小房间里呢，有和这个标签完美匹配的“挂钩”。
这就好比是，酶客人的衣服上有个特制的纽扣，而小房间里有个刚好能扣上这个纽扣的扣环。
我给你讲个我和我朋友小李做实验的事儿吧。
我们当时就想分离一种特定的蛋白质。
我们准备好了亲和层析的装置，就像精心布置好了聚会场地一样。
当我们把含有各种蛋白质的混合液倒进去的时候，就像是一群人涌入了聚会场地。
那些和我们目标蛋白质不一样的家伙呢，就像是在场地里随便逛逛的路人，他们在介质小房间里没有什么特别的吸引力，就继续随着液体流动，流到别的地方去了。
但是我们的目标蛋白质啊，一看到那个有着匹配“挂钩”的小房间，就像失散多年的朋友重逢一样，一下子就紧紧地结合在上面了。
这时候，我们就可以把那些还在流动的、不需要的蛋白质都冲走，就像把那些闲逛的路人请出场地一样。
然后呢，我们怎么把我们紧紧结合在小房间里的目标蛋白质拿下来呢？这就像是要把紧紧抱在一起的好朋友分开，有点难，但也有办法。
我们可以改变一些条件，比如说改变溶液的酸碱度或者盐浓度之类的。
亲和色谱模拟分离过程
亲和色谱，也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
该方法依赖于键合在固定相上的配体与生物活性目标分子间的特异性识别与可逆的亲和力作用，实现生物分子选择性分离。
在实际操作过程中，首先将待分离的物质连接到凝胶过滤色谱柱上，并确保连接的分子与待分离物质有一定的结合能力，这种结合是可逆的，即在改变流动相条件时可以相互分离。
然后通过调整流动相条件使得待分离物质与基质之间的相互作用增强或减弱，从而实现分离。
亲和色谱法具有高分辨率、高选择性的特点，因此被广泛应用于复杂样品的分离纯化过程。
例如，可以利用亲和色谱法从混合物中纯化或浓缩某一特定分子，也可以用于去除或降低混合物中特定分子的含量。
此外，亲和色谱还可以用于从变性或功能不同的版本中分离活性生物分子，以及从大量粗样品中分离低浓度的纯化合物。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
ge亲和层析原理和方法
ge亲和层析原理和方法引言ge亲和层析（GE Affinity Chromatography）是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于蛋白质纯化和分析等领域。
本文将介绍ge亲和层析的原理和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。
一、ge亲和层析原理ge亲和层析原理基于生物分子之间的特异性相互作用，利用目标分子与特定配体之间的亲和力实现分离。
亲和层析的核心在于选择合适的配体，使其与目标分子具有高度的亲和力。
常用的配体包括抗体、金属离子、亲和标签等。
二、ge亲和层析方法1. 列层析法列层析法是ge亲和层析的常用方法之一。
将配体固定在层析柱上，将混合物（包括目标分子和其他杂质）加入柱上，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法操作简单、适用于大规模制备。
2. 批次层析法批次层析法是ge亲和层析的另一种常用方法。
将配体固定在固相材料上，将混合物与固相材料混合搅拌，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法适用于小规模制备和快速分离。
三、ge亲和层析的应用1. 蛋白质纯化ge亲和层析广泛应用于蛋白质的纯化。
通过选择合适的配体，可以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化，提高纯化效率和纯度。
2. 抗体结合分析ge亲和层析可用于抗体结合分析，通过配体选择性地捕获目标抗体，实现对抗体结合特性的研究。
这对于药物研发和免疫学研究具有重要意义。
3. 蛋白质相互作用研究ge亲和层析还可用于研究蛋白质的相互作用。
通过将不同的配体固定在柱上，可以捕获目标蛋白质的结合伴侣，进一步揭示蛋白质相互作用网络。
4. 基因工程和生物药物制备ge亲和层析在基因工程和生物药物制备中有广泛应用。
通过选择合适的配体，可以实现对表达蛋白质的纯化和分离，提高生物药物的纯度和质量。
结论ge亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，通过选择合适的配体和方法，可以实现对目标分子的高效分离和纯化。
它在蛋白质纯化、抗体结合分析、蛋白质相互作用研究以及基因工程和生物药物制备等领域具有广泛的应用前景。
第六章 亲和分离技术
（3）葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应 用受到限制。 （4）聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲 和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
（5）多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非 特异性吸附，化学活性基团少。 （6）其它载体——壳聚糖
（5）辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP （adenosine triphosphate）等。 这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP（adenosine 5'-monophosphate）、 ADP （adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶 的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。
（4）凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和 抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做 糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。 pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时 为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间 通过二硫键结合。因此，在利用con A为配基的亲和分离 技术中，操作条件应当适宜。
三、亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可 特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中 高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基 （ligand），用L表示。
亲和层析分离纯化酶的原理
亲和层析分离纯化酶的原理亲和层析分离纯化酶的原理是利用酶与其特异的亲和剂之间的非共价相互作用，通过亲和剂与酶的结合，并将目标酶从复杂的混合物中分离出来。
亲和层析分离纯化酶的步骤一般包括以下几个方面：1. 亲和剂的选择：首先需要选择一个适合的亲和剂，其结构要与目标酶的特异性结合位点相互作用。
一般常见的亲和剂有金属离子、抗体、染料、亲和配体等。
2. 酶的固定化：将亲和剂固定在某种载体上，如凝胶或固体颗粒。
此步骤可通过共价键或非共价键将亲和剂固定在载体上，以使其具有固定酶的能力。
3. 样品处理：混合物中含有大量的非目标蛋白质，需要通过样品处理来去除这些干扰物。
常用的方法有脱盐、浓缩、去除杂质等。
4. 样品加载：将经过处理的样品加载到亲和柱上，使其中的目标酶能够与固定在柱子上的亲和剂发生特异性结合。
5. 洗脱目标酶：通过梯度洗脱的方法，将非特异性结合的蛋白质洗脱出来，而保留目标酶。
6. 蛋白质的回收：用合适的缓冲液洗脱目标酶，使其从亲和柱上析出，并收集回收。
以上就是亲和层析分离纯化酶的基本原理和步骤。
下面详细介绍几种常见的亲和层析技术：一、金属亲和层析(Metal affinity chromatography, MAC)：金属亲和层析是利用金属离子与酶的His残基之间的相互作用来实现酶的纯化。
常用的金属离子有Ni2+、Cu2+、Zn2+等。
MAC的优点是选择性高，具有较高的纯度和较高的回收率。
二、抗体亲和层析(Affinity chromatography, AC)：抗体亲和层析是利用抗体与酶的抗体结合位点之间的高亲和性相互作用来纯化酶。
AC可用于酶的高效纯化和富集研究。
抗体亲和层析的优点是能够高度特异性地识别目标蛋白质，但该技术的缺点是制备抗体的成本较高。
三、亲和配体亲和层析(Ligand affinity chromatography, LAC)：亲和配体亲和层析是利用有选择性地与酶结合的小分子化合物（亲和配体）来纯化酶，如亲和糖、亲和亲水剂。
亲和分离技术
影响因素
2nd 配基浓度对mA作用 图为 OGP 浓度对 con A 分配系数的影响，随着 OGP浓度增大，con A 的分配系数增大
影响因素
3rd 对适应pH范围的作用
图示: 通过添加亲和助表面 活 性 剂 可使目 标 产物 的萃 取pH范围增宽。 意 义 ： 因此利用亲和反胶 团萃取不仅可以提高目标产 物的分配系数 ( 回收率 ), 而 且由于萃取操作的 pH 范围 较宽，便于通过调节 pH 值 提高萃取分离的选择性。
机理:
对于多效价目标分子与配基结合,
1 1 Kd P L PLn n n
P-目标分子，L-配基，PLn-单目标 分子与n配基形成的复合体.
影响因素:
1 配基浓度和亲和分配系数Kd，[L]
or [PEG – L]，[PEG-L]/{[PEG-L] + [PEG]}
2 配基种类
操作过程:
亲和分离技术
More tech…
亲和萃取 亲和沉淀的基本原理和特点 分子印迹分离技术
2、亲和萃取
（ affinity partitioning ）
亲和萃取就是将亲和色谱的亲和配基用于萃取分离。 包括： • 亲和双水相 • 亲和反胶团
2.1 亲和双水相分配
传统的双水相体系 （aqueous two-phase extraction）
3 亲和沉淀 （affinity precipitation）
PEG=聚已二醇(polyethylene glycol) DX = 葡聚糖(dextran)
亲和分配(Affinity partitioning):
利用偶联亲和配基的 PEG 为成相 聚合物进行目标产物的双水相萃 取，可在配基的亲和作用下促进 目标产物在 PEG 相的分配，提高 目标产物的分配系数和选择性。 这就是亲和萃取，又称亲和分配.
亲和与印迹分离技术
亲和膜的制备过程
活化方法
1. 2. 3. 4. 5. • 环氧氯丙烷活化法 1,1’-羰基双咪唑（CDI ）法 三氯三嗪法 过碘酸钠法 戊二醛法 双环氧试剂活化法
环氧氯丙烷活化法
Cl OH OH
-
O OH O OH HN OH S OH R R RCl源自OH-O O
ROH RNH2 RSH
O O O
HO－C (532.9) (532.51) 49.74 (532.38) 70.47 (533.21) 56.82 (532.12) 100 (532.17) 79.61
C－O－C (534.3) － (533.84) 29.53 － － －
Alkali modificated HEC modificated HDA grafted Affinity membrane
间隔臂
• 当配基为小分子而纯化对象为大分子时， 需用间隔臂； • 可减小空间位阻，增大亲和容量； • 间隔臂一般为基质与配基间的长链分子； • 间隔臂长度要适当，过短起不到减小空间 位阻的作用，过长会弯曲封闭膜上的相邻 的活性位； • 一般取含六个碳原子的化合物：己二胺、 6-氨基己酸等。
间隔臂种类
—CF2 ， C ＝ O， O－C－O
(290.92) 32.51 (290.65) 31.4 (290.43) 24.91
55. 9 61. 4
HDA grafted Affinity membrane
56. 3 57. 5
21.8 23.0
18. 7 16. 5
3.2 3.0
(284.61) 31.71 (285.09) 55.98
介质 板式、卷式、中空纤维式超滤或微孔滤膜
规模 处理量大，可达克、甚至公斤级 处理量小，大多为mg级，制备级可达克级 成本 设备 速度 产物 相对较低 较简单 快 纯度相对较低 很高 较复杂 较慢 纯度很高
亲和色谱分离蛋白质原理
亲和色谱分离蛋白质原理
亲和色谱是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化蛋白质的色谱技术。
它的基本原理是利用固定在色谱柱上的亲和配体与目标蛋白质之间的特异性亲和力，从而实现蛋白质的分离和纯化。
具体来说，亲和色谱分离蛋白质的原理包括以下几个步骤：
1. 固定亲和配体：选择一种与目标蛋白质具有特异性亲和力的配体，并将其固定在色谱柱上。
常用的固定方法包括共价键结合、离子交换、亲和吸附等。
2. 上样：将待分离的蛋白质混合物加载到色谱柱上。
3. 特异性结合：目标蛋白质与固定在色谱柱上的亲和配体发生特异性结合，形成复合物。
4. 洗涤：用适当的缓冲液冲洗色谱柱，以去除未结合的杂质和非特异性结合的蛋白质。
5. 洗脱：改变缓冲液的条件，如pH、离子强度等，使目标蛋白质与亲和配体之间的亲和力降低，从而将目标蛋白质从色谱柱上洗脱下来。
亲和色谱具有高选择性、高效率、高纯度等优点，在蛋白质分离和纯化中得到广泛应用。
它可以用于分离和纯化各种蛋白质，如酶、抗体、受体等。
同时，亲和色谱也可以与其他色谱技术结合使用，如
离子交换色谱、凝胶过滤色谱等，以进一步提高分离效果和纯度。
第七章 亲和层析技术
第2章亲和层析1 亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。
在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。
所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。
将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。
将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。
图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。
根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。
表2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。
(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。
(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。
且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。
目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。
一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。
现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1 亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。
亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。
亲和层析的原理
亲和层析的原理亲和层析是一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
在亲和层析中，利用生物分子之间的特异性结合，将目标蛋白或其他生物分子从混合物中分离出来，从而实现其纯化和富集。
亲和层析技术已经成为生物化学和生物技术领域中不可或缺的一部分，被广泛应用于蛋白质纯化、抗体富集、药物筛选等多个领域。
亲和层析的原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是蛋白质与配体之间的结合，也可以是抗体与抗原之间的结合。
在亲和层析中，通常会使用具有特定亲和性的配体或抗体来固定在固定相（如琼脂糖、琼脂糖珠等）上，然后将混合物通过固定相，利用目标分子与固定相上的配体或抗体之间的特异性结合来实现目标分子的分离。
亲和层析的选择性和特异性是其最大的优势之一。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
此外，亲和层析还可以在温和的条件下进行，避免了对目标分子的结构和活性产生不可逆的影响。
因此，亲和层析在生物分离领域中具有广泛的应用前景。
亲和层析的原理还可以进一步细分为不同的类型，如亲和色谱、亲和吸附等。
在亲和色谱中，通常会利用配体与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离；而在亲和吸附中，则是利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现分离。
这些不同类型的亲和层析技术可以根据具体的实验需求进行选择和应用。
总之，亲和层析作为一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
亲和层析技术在生物化学和生物技术领域中有着广泛的应用前景，对于促进生物分离和纯化技术的发展具有重要意义。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
亲和层析的分离原理
亲和层析的分离原理嗨，朋友们！今天咱们来聊一聊一个超级酷的东西——亲和层析的分离原理。
这可不是什么枯燥的科学概念哦，它就像是一场奇妙的分子派对，特别有趣。
我有个朋友叫小李，他在实验室里整天捣鼓这些东西。
有一次我去他的实验室，看到那些瓶瓶罐罐和复杂的仪器，我就晕头转向了。
我问他：“小李啊，你这搞的亲和层析到底是啥玩意儿啊？”小李就特兴奋地开始给我解释。
亲和层析啊，它就像是一把超级精准的分子剪刀，能够把我们想要的东西从一堆乱七八糟的混合物里挑出来。
那它是怎么做到的呢？这得从它的核心部分说起，那就是亲和配体和待分离物质之间的特殊关系。
咱们可以把这个过程类比成找对象。
你看啊，在这个分子的世界里，有些分子之间就像是命中注定的一对儿。
比如说，抗原和抗体，它们之间的关系就像是两块拼图，严丝合缝。
亲和配体就像是那个专门吸引目标分子的磁石。
假如我们要分离一种特定的蛋白质，我们就会选择一种和这个蛋白质有高度亲和力的配体，把这个配体固定在层析柱上。
这时候，混合物里的各种分子就像是一群人在舞会上。
当这个混合物通过层析柱的时候，就好比这群人走过一条特殊的通道。
那些和配体没有缘分的分子啊，就像那些对舞伴不感兴趣的人，大摇大摆地就过去了。
而我们要找的那个目标蛋白质呢，就像一个急切寻找自己爱人的人，一看到固定在柱子上的配体，就立马黏上去了。
这就是亲和的力量啊！我当时就有点懂了，我又问小李：“那怎么把黏上去的东西再弄下来呢？总不能一直让它在柱子上待着吧？”小李笑了笑说：“这就涉及到洗脱的过程了。
”洗脱就像是一场巧妙的分手戏。
我们会用一些特殊的溶液，改变环境条件，让目标分子和配体之间的吸引力减弱。
这就好比给那对热恋的分子情侣制造了一些矛盾。
比如说，改变溶液的酸碱度或者离子强度。
这个时候，目标分子就像一个伤心的恋人，不得不离开配体，然后被洗脱液带着流出柱子。
再仔细讲讲这个固定亲和配体的层析柱吧。
这柱子就像一个神奇的小房子，里面住着我们的配体。
亲和膜分离技术及其在生物分离过程中的应用
目前用 于分离 和纯化 生物 分子 的方法 很多 ，如沉 淀法 、萃取 、 超 滤 、 凝胶 电泳 、 亲 和色 谱 、凝 胶 萃 取 、超 临 界 萃取 、逆 胶 束 萃取 、双水 相分配技 术等 ，但 是方法 较烦 琐 ，回收率较 低 。因此 ， 开发新型 技术 以及将 已有的分离技术集 成化成为提高 分离纯化效率 、 降低生产成本 的重要途径 。亲和膜分离技术 即为高效集成化分离技术 之一 ，自 １ ９ １年 Ｋ１ ｎ的亲和膜 （ ｆ ｎ ｔ Ｍ ｍ ｒ ｎ ９ ｅｉ Ａｆ ｉ ｉ Ｙ ｅ ｂ ａ ｅ）专著 出版 以来 ，亲和膜 技术 的研究 在多方 面都 有 了较 大 的发展 。 １ ２ 原理及优点 ．
１ ２ １ 理 ．． 原
秦 晓蓉等将 纤维素 滤纸进 行碱 处理及 环氧活化 、偶联 亚氨基二 乙酸 、固定 化铜 离子等处 理 ，并将其装 入 自制的色谱 柱管 ，制得 固 定化铜离 子亲和膜 色谱柱 。该柱 可用 于吸 附血红 蛋白，吸 附率可达
到９ Ｏ％ 以上 。
亲 和膜 分 离 技 术 （ ｆ ｉ ｉ ｙ ｅ ｂ ａ ｅ ｈ ｏ ａ ｏ ｒ ｐ ｙ Ａ ｆ ｎ ｔ ｍ ｍ ｒ ｎ Ｃ ｒ ｍ ｔ ｇ ａ ｈ ， Ａｃ Ｍ ）是将亲和分离与膜分离技术 结合起来的一项 新型分离技术 ，它将 带有亲和配基的分 离膜直接 用于生物 分子的分 离。 亲和膜 分 离技 术是 将亲 和 配体 结合 在分 离 膜上 ，利 用膜 做 基 质，对其进行改性，在膜的 内外表面活化并耦合上配基 ，再按吸 附、清 洗、洗脱、再生的步骤对生物产品进行分离 。当样品混合物缓慢地通 过膜 时，其 中与亲和配基有特 异性相互 作用 的分子和配基产 生耦合， 生成相应的配合物，然后再通过改变条件，如洗脱液组成、ｐ 值、离 Ｈ 子强度、温度 等，使 已和配基产生相互作用的配合物分子解离，将其 收集起来，再将膜进行洗涤、再生和平衡，以备下次分离样品时使用 。
亲和层析原理
亲和层析原理亲和层析原理是一种利用生物分子之间特异性相互作用进行分离的技术。
其基本原理是利用亲和配体和靶分子之间的特异性结合来实现对靶分子的选择性捕获和分离。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和素等，而靶分子则是需要分离或纯化的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
在亲和层析过程中，样品混合物首先通过填料，亲和配体与靶分子结合，非特异性的成分被洗脱，最后通过改变条件来实现靶分子的解离和纯化。
亲和层析原理在生物化学领域有着广泛的应用。
例如，在蛋白质纯化方面，可以利用蛋白质与亲和配体的特异性结合来实现对目标蛋白的高效纯化。
在药物研发中，亲和层析技术也被广泛应用于药物靶点的筛选和鉴定。
此外，亲和层析还可以用于分离和纯化DNA、RNA等核酸分子，具有广泛的应用前景。
与其他分离技术相比，亲和层析具有许多优点。
首先，它具有高选择性和高分辨率，可以实现对目标分子的高效分禶。
其次，亲和层析技术操作简单，易于扩展和自动化，适用于大规模生产。
此外，亲和层析技术还可以在温和的条件下进行，有利于保持靶分子的生物活性。
然而，亲和层析技术也存在一些局限性。
首先，亲和层析柱的填料选择和修饰需要针对不同的亲和配体和靶分子进行优化，成本较高。
其次，亲和层析柱的再生和重复使用也是一个挑战，需要综合考虑填料的稳定性和再生性。
综上所述，亲和层析原理是一种重要的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对其基本原理、应用领域以及优缺点的了解，可以更好地应用亲和层析技术进行生物分离和纯化，推动生物医药和生命科学领域的发展。
亲和层析分离纯化技术
亲和层析分离纯化技术亲和层析分离纯化技术，这可是个厉害的玩意儿呢！咱就这么说吧，它就像是一位超级厉害的伯乐，能从一堆“千里马”中精准地挑出那匹最特别的。
你看啊，在这个复杂的生物世界里，各种物质混合在一起，就好像是一场混乱的派对。
而亲和层析呢，就像是派对上那个最有眼光的人，能一下子找到它要找的目标。
它的原理其实也不难理解。
就好比你有一个特别喜欢的东西，比如一个特定的玩具，然后你就会对这个玩具特别敏感，能一下子在一堆玩具中找到它。
亲和层析就是利用这种类似的原理，通过一个特定的“结合位点”，去和目标物质紧密结合。
比如说，咱要纯化一种蛋白质。
那亲和层析就会用一个专门针对这种蛋白质的“诱饵”，把它给吸引过来，然后牢牢地抓住它，其他的杂质就被排除在外啦。
这多厉害呀！这技术在生物领域的作用那可太大了。
就好像是一个神奇的魔法棒，能让科学家们在研究和应用中如鱼得水。
想想看，如果没有亲和层析，要从那么多复杂的混合物中分离出我们想要的东西，那得费多大的劲啊！简直就像是在大海里捞针。
但有了它，就像是有了一双神奇的眼睛，一下子就能找到那根针。
而且啊，亲和层析还特别精准。
它不会随便乱抓一气，而是只针对它设定好的目标。
这就好比一个神枪手，一枪一个准，绝不会打偏。
它的应用那也是相当广泛呢！在制药行业，能帮助分离出有效的药物成分；在生物技术领域，能助力研究各种生物分子的特性。
这不就是在为我们的科技进步添砖加瓦嘛！再想想，要是没有亲和层析，我们怎么能得到那么纯净的生物制品呢？那我们的医学研究、药物开发不都得受到很大的影响嘛！所以说呀，亲和层析分离纯化技术真的是太重要啦！它就像是一位默默无闻的英雄，在背后为我们的科技发展贡献着自己的力量。
我们真应该好好感谢它，不是吗？你说，这么厉害的技术，我们能不好好研究它、利用它吗？它可真是生物领域的一大宝贝呀！。
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α-2-巨球细胞
S-23 骨髓瘤蛋白 3-氧代类固醇异构酶 胰蛋白酶
Cu2+
二硝基酚 雌甾二醇l 对氨基苯咪
PEG/dextran
PEG/dextran PEG/ dextran PEG/dextran
6.1.2 亲和配基高聚物的合成
亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下 相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体 系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通 过化学方法结合在PEG上。
二次作用亲和沉淀
制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、 温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶 性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质 与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。
特异性结合 目标分子
形成 亲和沉淀
目标分子 解离
亲和沉淀原理图
亲和沉淀的优点
溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻， 亲和结合速度快，结合充分； 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率
目标蛋白质的结合位点不被配基－聚合物饱和时
KC K P 1 (CL kd )1
N
1 (CL
kd ) 2
N
6.1.4 亲和分配的应用
乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation)
一次作用亲和沉淀
水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基， 即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand) 通过与多价蛋白质 (multivalent protein) 支联，在适 当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原－抗体的沉淀作用相 似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率 最高。
第六章
6.1 6.2 6.3 6.4 6.5
亲和分离技术
亲和萃取 亲和沉淀 亲和膜技术 分子印迹分离技术 亲和反胶团萃取技术
6.1 亲和萃取
亲和萃取简介
亲和配基高聚物的合成
亲和分配的影响因素和亲和模型 亲和分配的应用
6.1.1 亲和萃取简介
萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离 技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。 亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分 离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。
主要包括以下两种:
PEG 的活化 亲和配基直接反应
6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型
影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如 PEG浓度，还有: 配基浓度 配基载体 染料配基 pH: 增加，效率降低 温度: 升高，效率降低 盐浓度
亲和分配的影响因素和亲和模型
盐对分配系数的影响 盐的种类
88
81 89 33 21 —— —— 1 ——
临苯二甲酸钾
NaClO4
——
——
48
42
——
——
亲和分配的影响因素和亲和模型
体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时
亲和分配的影响因素和亲和模型
整个过程的自由能变可以列成如下算式
ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1
G1 RT ln(kd )1
G4 RT ln(k d ) 2
磷酸钠（添加）
添加盐时的△log K占不添加盐时的百分数（％） 25mM 100 63mM 103 250mM ——
甲酸钠，pH7
醋酸钠，pH7 丙酸钠，pH7 Na2SO4 KCl Li2SO4 Tris，pH7 KI NaSCN
——
105 —— 98 104 —— —— 97 ——
——
97 —— 85 80 77 76 69 67
亲和萃取简介
常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质 分离蛋白
白蛋白 碱性磷酸化酶 共脂肪酶（Colipase） 脱氢酶，激酶
亲和配基
脂肪酸 Procion red HE-3G 卵磷脂Lecithin 活性染料
体系 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐
G2 RT ln K L
G3 RT ln K p
G5 RT ln K c
亲和分配的影响因素和亲和模型
推导得
K c (k d ) 2 K L (k d )1 K P
有N个结合位点的蛋白质而言
KC (kd ) 2 K L (kd )1 K P
N
log K max log(K C K P ) N log K L
一次作用亲和沉淀
一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别 是4价以上的蛋白质 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分 离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用 上存在较大难度。 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配 基自交联(ligandself-assoliation)的现象，成为交 联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所 以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。
6.2 亲和沉淀分离技术
亲和沉淀的原理
亲和沉淀聚合物和亲和配基
亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基 亲和沉淀的展望
6.2.1 亲和沉淀的原理
亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性 识别与沉淀分离相结合的纯化技术。 亲和沉淀的机理：
配体的连接
加到含有目标 分子得溶液中