4 2014 叶绿体色素含量的测定
叶绿体色素含量的测定
叶绿体色素含量的测定叶绿体色素含量的测定，这听起来像是科学家的秘密任务，其实说白了就是要看看植物里那些神奇的绿色成分有多少。
大家都知道，植物的颜色基本上是靠叶绿素撑起来的，没了它，植物也就变得跟枯树一样无趣。
所以，今天我们就来聊聊，怎么在实验室里动手动脚，测测这些色素的含量。
我们得准备好一系列工具。
想象一下，实验室里一片忙碌的景象，试管、烧杯、移液管，全都整齐地排开。
嘿，这可不是大厨的厨房，而是科学家们的“战场”。
我们要做的第一步，就是找些新鲜的植物叶子。
最好是那些绿得发亮的，不然会让你失望得想哭。
选好了叶子，接下来就要把它们磨碎，变成一堆绿色的糊状物。
这个过程就像是在做绿豆沙，越细腻越好，嘿嘿。
我们要用溶剂把这些色素提取出来。
这里可有讲究，不同的溶剂对色素的提取效果可是大相径庭。
有的可能会让你的色素提取得像黄金一样闪闪发光，而有的则可能让你一脸无奈，只能看着那些植物的色素慢慢溜走。
你要小心啊，不然就像做饭时放盐放多了，糟糕透了。
提取完色素，我们就可以开始测量了。
这一步可是最关键的，直接关系到你这次实验能不能算成功。
通常，我们会用分光光度计来测量色素的吸光度。
这玩意儿就像是植物的“身份证”，能告诉你它们的色素含量。
调好仪器，按下按钮，看着屏幕上出现的数字，简直就像看电影的高兴部分，紧张又兴奋。
得出的数据只是个开始。
接下来就是分析和计算，估算一下叶绿素的含量。
你得带上你的计算器，准备好数一数。
可别小看这个过程，跟做数学题差不多，有时候还得使点小心思。
算得越精确，越能说明你这次实验的“底气”，就像考卷上的分数，关乎你的荣誉。
如果一切顺利，得到的结果让你满意，那真是高兴得像打了胜仗一样。
想想那些努力磨碎叶子、提取色素的日子，突然觉得一切都是值得的。
可如果结果不如预期，那也没关系，科学就是这样，有时候就是得经历点“波折”。
总结经验，下次努力不懈，才能攀上更高的峰顶。
叶绿体色素含量的测定不仅仅是个实验，更像是一场冒险之旅。
实验四叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定
实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。
实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。
（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。
测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。
其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定
叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。
叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。
另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。
因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。
实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
纸层析是其中最简单的一种。
当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。
强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。
而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。
叶绿素含量的测定
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶用乙醇或丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用乙醇或丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用乙醇或丙酮定容至25mL ↓ 置分光光度计测定 (注意:不同提取溶剂波长不同)
四. 结果计算
注意分光光度计的规范使用
六. 思考题
为什么植物在不同生长环境下其 Chl含量 有差异？ Chla /Chlb有何适应意义？
实验二. 叶绿素含量的测定
高等植物光合作用过程中利用的光能是 通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿 体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素 和叶黄素组成。 在植物光合生理、发育生理和抗性生理 研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿 素含量也是指导作物栽培生产和选育作 物品种的重要指标。
一.实验原理
组织变白，在暗处静止3-5min后，用滤纸过滤
到25ml容量瓶中。
注意：用滴管吸取96%乙醇或80%丙酮将研钵洗净，
清洗液也要过滤到容量瓶中，并用96%乙醇或 80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残 渣全部变白后，用96%乙醇或80%丙酮定容至刻 度。
3．读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注 意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素 提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触 比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒
4.1 结果计算
C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数
Chl = (mg/g叶)
材料鲜重（g）
4.2 比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同 种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。
五. 注意事项
注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。
已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。
解方程（1） （2）组得C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝5.341000652 A (6)有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。
叶绿素测定分光光度法
叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。
叶绿体色素80 ％丙酮提取液中叶绿素a 和 b 及类胡萝卜素分别在663nm 、646nm 和470nm 波长下有最大吸收峰，而95 ％乙醇提取液中它们则在665nm 石49nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
[ 实验目的]掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。
[ 器材和试剂]1 ．植物材料新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。
2 ．实验器材分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。
3 ．实验试剂80 ％丙酮（或95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。
[ 操作步骤］1 ．色素的提取①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml80 ％丙酮（或95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮10ml ，研成匀浆，暗处静置约10m in 。
②将提取液过滤到50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。
最后用丙酮定容至50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。
叶绿素含量的测定及计算
叶绿素含量的测定及计算叶绿素含量的测定及计算方法如下：1. 原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
2. 计算公式：根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=acl。
式中：a为比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a 为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
3. 测定波长的选择：在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、h的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663 nm 和645 nm，又知在波长663 nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645 nm下分别为16.75和45.60。
4. 计算：叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）和类胡萝卜素（Cx）的浓度可以根据测定的波长吸光度计算得出。
计算公式如下：Ca=（13.95*A665-6.88*A649）；Cb=（24.96*A649-7.32*A665）；Cx=（1000*A470-2.05*Ca-114.8*Cb）/245。
5. 叶绿素含量计算：根据求得的色素浓度（mg/L），再计算出各色素含量（mg/g鲜重表示）。
叶绿素含量（mg/g）=（色素浓度mg/L * 提取液体积ml * 稀释倍数）/(1000 * 样品鲜重g)。
上述信息仅供参考，如果想要获取更多关于叶绿素含量测定的专业指导，可以查阅相关的学术文献或者咨询专业科研人员。
叶绿体色素测定方法
叶绿体色素测定方法实验、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法沈阳农业大学：高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。
叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。
叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反j 叶片生理状态的重要指标。
在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
[原理]叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂。
它可以通过研磨或用各种有机溶剂浸泡来提取，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜。
叶绿色素在特定的萃取溶液中对特定波长的光有最大的吸收。
用分光光度计测量该波长下叶绿素溶液的吸光度（也称光密度），然后根据该波长下叶绿素的吸收系数计算叶绿素含量。
利用分光光计测定叶绿素含量的依据是lambert-beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
其数学表达式为：a=kbc式中：a为吸光度；k为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。
叶绿素a和B丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别为663nm和645nm。
叶绿素a和B在663nm处（溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为GL-1）的吸收系数分别为82.04和9.27；在645nm处的吸收系数分别为16.75和45.60。
根据朗伯-比尔定律，叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（a663和a645）与叶绿素a之间的关系，B和溶液中的总浓度（a+B）（CA，CB，CA+B，单位：GL-1）可以用以下方程式表示：a663=82.04ca+9.27cb （1）a645=16.76ca+45.60cb（2）解方程（1）和（2）：ca=12.7a663―2.59a645(3)cb=22.9a645―4.67a663(4)ca+b＝20.3a645－8.04a663（5）从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。
植物叶绿体色素含量的测定
实验四植物叶绿体色素含量的测定高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。
叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。
在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
一、原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。
根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。
式中：a为比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、植物材料、仪器设备及试剂配制：（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。
（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙三、实验步骤：1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定ﻫ一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 与液层厚度Ｌ成正比,即A ＝αCL式中:α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1ｃｍ时,α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总与。
这就就是吸光度的加与性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 与类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a 、叶绿素b 的8０%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于6６３、６45nm 处。
已知在波长66３nm 下叶绿素a 、叶绿素ｂ在该溶液中的吸光系数的分别为８2.04与９、27;在波长645n ｍ处的吸光系数分别为1６、75与45.60。
根据加与性原则列出以下关系式:A663=82、04Ca+9、2７Ｃb (1) A645＝16、76Ca+4５、6０Cb (２)式(1) (2)A 6６３nm 与Ａ６45nm 为叶绿素溶液在66３nm 与６45n ｍ处的吸光度,C ａ C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度,以m ｇ/L 为单位。
解方程(1) (2)组得Ｃa =12.72 A 663—2、59 A 64５ (3) C b =22、８８ A ６４５—4、67 Ａ６63 (4) 将Ｃa +Ｃb 相加即得叶绿素总量C ＴC T ＝ C a 十C b ＝20、２９A 645—8、0５ Ａ66３ (5)从公式(３)、(4)、(5)可以瞧出,,就可计算出提取液中的叶绿素ａ、b 浓度另外,由于叶绿素ａ 叶绿素b 在６5２ｎｍ的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数(均为３0、５),也可以在此波长下测定一次吸光度(A 652)而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算: C T ＝5.341000652 A (６)有叶绿素存在的条件下,用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定 Last updated at 10:00 am on 25th December 2020植物生理学实验报告实验题目：叶绿素含量的测定姓名班级学号一、实验原理和目的根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。
叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。
叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量二、实验器具和步骤植物材料：女贞实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀试剂： 95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉步骤：1.称取剪碎的新鲜样品左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。
静置3～5min2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。
以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度5. 计算公式：叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。
Ca=－；Cb=－C=类单位：mg/L三、实验数据和作业2、计算叶绿素含量计算公式：叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。
Ca=－；Cb=－C类=单位：mg/L由上面的公式进行代入计算，有：Ca=* Cb=* C类=（1000*）/245=则：叶绿素含量=（*10**1）/=四、数据分析实验中可能清洗研钵和滤纸不是特别干净可能造成误差五、思考题为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？答：因为叶绿素存在于叶绿体内囊体上与其上的蛋白质组成色素蛋白复合体，要分离叶绿素和蛋白质必须有水，叶绿素的头部为极性的，有亲水性。
实验4 叶绿体色素的吸收光谱曲线及含量的测定
实验二叶绿体色素吸收光谱曲线及含量的测定一、实验目的掌握分光光度计的使用方法，学会绘制叶绿体色素的吸收光谱曲线。
了解叶绿体色素含量测定的原理，掌握叶绿体色素含量测定的方法。
二、实验原理叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光谱最强的吸收区有两个：一个在波长640~660nm的红光部分，另一个在波长430~450nm的蓝紫光部分。
在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带，其中尤以对绿光的吸收最少。
胡萝卜素和叶黄素的最大吸收带在蓝紫光部分，不吸收红光等长波的光。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：D＝KCLD：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度,K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm。
95 ％乙醇提取液中叶绿素a 和b 及类胡萝卜素分别在在665nm 、649nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
三、实验材料及器材仪器及试剂：研钵、量筒、滴定管、烧杯、比色杯、滤纸、脱脂棉、分光光度计、95%乙醇材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称取1g菠菜叶片，加入少许95%乙醇，研磨，用量筒定容至25ml。
2、吸收光谱去1ml提取液，加3ml95%乙醇，置于比色杯中，用95%乙醇作为对照，在400~700nm 之间每隔20nm测一次光，记录波长和吸光度D于下表中，并在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲线。
λ（nm）400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 A3、将色素提取液充分混匀后，取光径1cm 的比色杯，注入提取液，以95%乙醇作为空白对照，在波长665nm 、649nm 和470nm 下测定吸光度（、和）。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定
叶绿体色素的提取、分离及含量测定一、实验原理叶绿体色素是植物进行光合作用吸收光能的重要物质基础。
叶绿体色素主要包含叶绿素a, 叶绿素b,叶黄素和胡萝卜素。
利用四种不同色素在流动相（扩展剂）和固定相（滤纸中吸附的水）中的分配系数不同而将其分开；叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素80％丙酮提取液中叶绿素a和b分别在663nm、646nm波长下有最大吸收峰，据此所测得的吸光值代入不同的经验公式，计算出叶绿体色素丙酮提取液中叶绿素a和b的浓度及总浓度，并依据所使用的单位植物组织，求算出色素的含量。
二、实验目的掌握用纸层析法提取分离叶绿体色素的原理和方法；掌握叶绿体色素提取液中叶绿素a和b的浓度及其总含量的测定与计算方法。
三、器材和试剂1、植物材料：新鲜菠菜2、实验器材：电子天平、分光光度计3、实验试剂：丙酮、扩展剂四、操作步骤1、色素的提取1）称取新鲜的洗净擦干的植物叶片0.5g ，去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英沙和碳酸钙，再加入2ml 丙酮，研磨成匀浆后再加入4ml 丙酮，放暗处静置萃取5min 后过滤（取滤液进行纸层析），再用4ml80％丙酮冲洗研钵和研棒后也一并进行过滤2、纸层析1）准备滤纸2）点样3）层析 时间40分钟左右4）层析结果3、含量测定1）去除残渣，取上清液，用80％丙酮定容至10ml 。
2）取1ml 稀释溶液，加4ml80％丙酮稀释5倍。
3）吸光度的测定以80％丙酮为对照，分别测定663nm、646nm 波长下的光吸收值五、结果计算80％丙酮提取液中色素浓度计算公式：C a =12.21A 663-2.81A 646C b =20.13A 646-5.03A 663C T =C a +C b =17.32A 646＋7.18A 663浓度单位：mg/L单位植物组织中叶绿体色素的含量：叶绿体色素的含量＝色素的浓度（mg/L）×提取液体积（L）×稀释倍数/样品鲜重。
叶绿体色素含量的测定实验流程
叶绿体色素含量的测定实验流程
取新鲜的植物叶子（或其他绿色组织）或干燥的材料，擦去组织表面的污垢，去除中脉，切块。
称取2g新鲜切碎的样品，放入研钵中，加入少量石英砂、碳酸钙粉和3mL 95%乙醇，研磨成均质浆液，加入10mL乙醇，继续研磨至组织变白.静置 3 到 5 分钟。
取1张滤纸放入漏斗中，用乙醇润湿，沿玻璃棒倒出提取液。
倒入漏斗中，滤液流入100mL棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、杵和残渣数次，最后与残渣一起倒入漏斗中。
用滴管吸去乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直到滤纸和残渣没有绿色为止。
最后，用乙醇定容至 100 mL，摇匀。
取叶绿体色素提取物，在665nm、645nm和652nm波长处测定吸光度，以95%乙醇作为空白对照。
叶绿体色素含量的测定
叶绿体色素含量的测定----分光光度法中文摘要：本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。
英文摘要：In this experiment , we used spinach leaves as raw material and used 80% of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment. 实验原理：利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。
根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。
实验目的：掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
实验器材和试剂：1、材料：菠菜叶片2、用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。
2.吸光度的测定取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。
3.结果计算依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比,即A ＝αCL式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数.各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得.如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和.这就是吸光度的加和性.今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度.在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰. 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。
已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82。
04和9.27;在波长645nm 处的吸光系数分别为16。
75和45。
60。
根据加和性原则列出以下关系式：A663=82。
04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45。
60Cb （2）式（1) （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度,以mg/L 为单位. 解方程（1） （2）组得C a =12.72 A 663-2.59 A 645 (3） C b =22。
88 A 645—4。
67 A 663 （4） 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20。
29A 645—8.05 A 663 （5） 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，,就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数（均为30。
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计算浓度和含量
实验结果
注意事项
1.为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进
行，研磨时间尽量短些
2.注意叶绿素一定要提取干净，避免造成测定误差
3. 叶绿素提取液不能混浊
4.分光光度计转换波长时要重新调零 5.实验过程中使用同一台分光光度计测量
思考题
1、分光光度法与一般的比色法有何异同？ 2、叶绿素a和b在蓝光区也均有最大吸收峰，能 否用这最大吸收峰波长进行叶绿素的定量测定 分析？为什么？
下周实验内容
植物呼吸强度的测定 （瓦氏呼吸计法）
出其浓度
叶绿素a :663nm 处最大吸收峰； 叶绿素b: 645nm 处最大吸收峰； 且两吸收曲线相交于652nm 处
663nm
645nm
蓝紫光区
红光区
类胡萝卜素→吸收兰紫光，不吸收红光等长 波长的光 叶绿素→吸收红光、兰紫光
在测定叶绿素a、叶绿素b时，为了排除类胡
萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿
分光光度计使用方法
1. 开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟。 2. 波长调至测试用波长。 3. 开盖T调0。 （调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”） 4. 放入空白对照液，将光路对准空白对照位置 5. 关盖T调100。 （调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”） 6.调A为0。 （调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”） 7. 将被测样品移入光路，进行测定，显示值即为被测样品的吸 光度值。
实验材料与器材
◇实验材料：青菜 ◇实验器材：50ml容量瓶、小漏斗，5ml移液管一 只，研钵一套，剪刀一把，滤纸，天平，722型 分光光度计 ◇实验试剂：80%丙酮
实验步骤 1
1.鲜叶洗净，吸水纸吸干，称取0.5克（避开主叶
脉）剪碎置于研钵中加少量石英砂和80%丙酮（约 2-3ml）研成匀浆； 2.倒入约20ml 80%丙酮，静置10分钟； 3.将上清液沿玻棒移入过滤的漏斗中（滤纸用80%的 丙酮湿润），滤入50ml容量瓶中； 4.残渣留在研钵里，再用80%丙酮反复提取2-3次， 直至残渣变白无绿色； 5.然后用丙酮液冲洗滤纸变白为止； 6.再用丙酮液定容到刻度，即为叶绿素提取液。
实 验 原 理1
◇根据朗伯-比尔定律 当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与 溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 ◇即：A = K * L * C K：比吸收系数 L：液层厚度 C：溶质浓度 (克/L)
比吸收系数()的物理意义
Lambert-Beer 定律中的比例系数“K ”的物理意义是：
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度
素在红光区的最大吸收峰。
叶绿素a和叶绿素 b的80%丙酮溶液， 当浓度在1g/L时， 比吸收系数k值:
波长 （nm） 663 645
K值
叶绿素a
82.04 16.75
叶绿素b
9.27 45.60
663nm 645nm
据此可列出下列方程式：
A663= A叶绿素a + A叶绿素b A663= Ka L Ca + Kb L Cb A663 = 82.04 Ca + 9.27 Cb……………(1) A645 = 16.75 Ca + 45.6 Cb……………(2)
实验步骤 2
◇将上述提取液注入1cm光径的比色皿中 （以80%丙酮液为对照） ◇用分光光度计分别在645nm、663nm、470nm处读取 光密度。
Ca = 12.7A663-2.69A645 Cb = 22.9A645-4.68A663
C类胡萝卜素=(1000A470 – 3.27Ca – 104Cb)/229
A663、A645分别为叶绿素溶液在波长663、645nm处的光密度; Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(单位:克/升)
将上式整理，可以得到下式：
Ca (g/L) = 0.0127A663-0.00269A645 （3） Cb (g/L) = 0.0229A645-0.00468A663 （4）
(单位：mg/L)
实验步骤 3
将读取的光密度A645和A663，计算提取液叶绿素a、b和类胡萝 卜素的浓度或叶绿素的总浓度，然后按下式计算叶绿素类胡 萝卜素在叶片中的含量： 叶绿素含量或类胡萝卜素(鲜重%)=
或：叶绿素含量或类胡萝卜素(毫克/克鲜重)=
实验步骤
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶,用80%丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用80%丙酮定容到50ml ↓ 测A645、A663、A470
将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为： Ca (mg/L) = 12.7A663-2.69A645 （5） Cb (mg/L) = 22.9A645-4.68A663 （6） －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 （7） CT为叶绿素的总浓度
比吸收系数()的性质
① κ与溶液的浓度和液层厚度无关，与吸光物质的特性及光 的波长等有关，也受温度和溶剂的影响。
② 对于同一波长下，当其他条件一定时(温度、溶剂等) ，κ 的大小取决于物质的性质。 ③ 对于同一物质，当其他条件一定时(温度、溶剂等) ，κ的 大小取决于波长。 ∴ κ能表示物质对某一波长的光的吸收能力。 κ越大，表明物质对某波长的光吸收能力越强。
实 验 四
叶绿体色素含量的测定 （分光光度法）
实 验 目 的
◇叶片的叶绿素含量直接影响着光合速率，并与氮 素营养有密切的关系，在栽培、生理、农化、育 种等研究上是重要的诊断指标，常需测定和控制 叶绿素含量。 ◇掌握使用分光光度计定量测定叶绿素含量
叶绿素含量测定方法
叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间 接计算叶绿素的含量 2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在 最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯-比尔定律计 算出提取液中各色素的含量
实 验 原 理2
吸光度的加和性
◇如果溶液中有数种吸光物质，则此混合
液在某一波长下的总吸光度等于各组分 在相应波长下吸光度的总和 ◇即：A = A1 + A2 +…… + An
叶绿体色素提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素; 只需测定该溶液在三个特定波长下的吸光度;
根据这三个色素在该波长下的吸光系数即可求
பைடு நூலகம்
663nm 645nm
蓝紫光区 470nm
红光区
类胡萝卜素含量的测定
在叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测 定溶液中的类胡萝卜素含量 在80％丙酮提取液中三种色素含量的计算公式 (单位：mg/L)：
C类胡萝卜素=(1000A470 – 3.27Ca – 104Cb)/229
◇由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光 谱有差异，因此，使用其他溶剂提取色 素时，计算公式有所不同