3谷氨酸发酵菌总结

不到完整的菌体细胞。
上升、耗糖缓慢
发酵中后期
细胞形态不规则，边缘不整齐， 毛刺状，有细胞碎片。
OD值下降，泡沫多，粘 度大、耗糖缓慢等， 补加适量营养物可 适当挽救。
§3 谷氨酸发酵的育种
策略：以日常维护优选为背景……
高糖
高谷 氨酸
代谢 控制
诱变
细胞 工程
谷氨酸 生产菌
选择 压
基因 工程
细胞 融合
Байду номын сангаас
B9 大 伸 长 不在该 pH 范围 草 黄 5-8ug/L 生物素 短 同，不会
膨大
色
交叉 感
染
后提取容易， 收率较高，质
量较好
分泌色 素较多
天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌(B9)的比较
菌种 T613 B9
细胞 大小 小
大
细胞 形态
变化 更大
伸长 膨大
等电点
pH3.0-4.2 接 近谷 氨酸结晶等电点
皱，甚至残缺不齐，菌体形态基本清楚
发酵后期
细胞较长，有模隔的多节花生状，产酸高。
感染噬菌体后：
感染时期 发酵前期
细胞形态
生产表现
菌体细胞明显减少，细胞不规则， 排气口二氧化碳迅速下
发圆，发胖，缺乏V字形排列， 降，相继出现OD值
细胞碎片，严重时出现拉丝、 拉网，互相堆在一起，几乎找
下跌、pH上升或不
日常菌种工作
定期分纯 小剂量诱变刺激 高产菌制做安瓿管
育种方法
1 自然选育与诱变育种
自然选育 诱变育种 变异幅度大于自然选育。 2 代谢控制育种
选育细胞膜渗透性好的突变株
抗VP类衍生物 选育对溶菌酶敏感突变株 选育二氨基庚二酸缺陷突变株 选育温度敏感突变株
n-石蜡
磷脂质
不在该 pH 范围
菌落 颜色
淡白 色
草黄 色
生 物素 用量
较 B9 低 20-50%
5-8ug/L
糖酸 转化 率 高
低
发酵温度
前
期
32-34℃
中后期
36-38℃
前
期
30-32℃ 中后期
34-35℃
噬菌 体类 型 交叉 感染
T613感染噬菌体时，不能换用 B9，调换7338.
目前味精行业采用的主要菌株
★ 普通肉汁液体培养：稍浑浊，有时表面沿管壁呈薄环状，摇动培养 管，底部有粒状沉渣。
★ 普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长弱，且不向四周 扩散。
★ 明胶平板及明胶穿刺：菌落形状不规则，扁平，边缘不整齐，淡黄 色。穿刺培养时，沿穿刺线生长不明显，表面发育良好。不液化明胶。
★ 马铃薯块：培养三周仍不生长。
Microbacterium 节杆菌属 球形节杆菌 Arthrobacter globiformis
Arthrobacter
短杆菌科(Brevibacteriaceae)
短杆菌属 Brevibacterium
乳糖发酵短杆菌 B. lactofermentum 叉开短杆菌 B. divaricatum 黄色短杆菌 B. flvum 硫殖短杆菌 B. thiogenitalis 产氨短杆菌 B. ammoniagenes
北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较
菌种 细 胞 细 胞 等电点
菌 落 生物素 生长因 发 酵 噬 菌 体
大小 形态
颜色 用量 子 周期 类型
7338 小 变 化 pH3.0-4.2 接近谷 乳 白 4-5ug/L 生物素 长 感 染 噬
不大 氨酸结晶等电点 色
和硫胺
菌体 的
素
类型 不
北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征
(2) 培养特征
★ 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，24h 白色，48h淡黄色，颜色逐渐加深，表面光滑、湿润、有光泽，无黏 性，无水溶性色素。
★ 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形， 24h白色，48h淡黄色，中央隆起， 表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生 水溶性色素。
国内谷氨酸生产主要菌株
天津短杆菌 (T613)及其突变株 钝齿棒杆菌(AS1.542)用其突变株 北京棒杆菌(AS1.299)及其突变株
1 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征
(1) 形态特征
短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多 种形态。
单个、成对及“V”字形排列。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 (3) 生理特征 ★ 对氧的要求：兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株20~37 ℃ 培养生长良好，不耐高温，42 ℃ 不生长。 ★ pH的影响： pH6~9生长良好， pH10生长微弱， pH4~5已不能生长。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 ★ 水解淀粉。 ★ 不分解纤维素。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子。
培养过程中，球菌 杆菌，杆菌 球菌。G+ G- , G- G+
Corynebacterium：放线菌目中一属革兰染色阳性、 不运动、非抗酸性、无芽孢的杆菌。菌体直形、 弯形或多形，常呈棒状。一般不运动。好氧或兼 性厌氧，化能有机营养型。进行氧化性或发酵性 代谢。过氧化氢酶阳性。G+Cmo1%值为51～59。
§2 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化
细胞壁 细胞形态
+
生物素 细胞壁
过程变化
斜面
小，革兰氏染色浅
种子
大而粗壮，革兰氏染色深
第一个10小时 大而粗壮，革兰氏染色深
第二个10小时
细胞形态急剧变化，伸长、膨大。非积累型积 累型。
伸长，膨大，不规则状，缺乏“V”字形排列，有 16或20小时后 的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊，有的边缘褶
磷酸
R1和R2： 烃基
R3： 乙醇胺 丝氨酸 肌苷酸 胆碱
磷脂
生物素：是脂肪合成中关键酶—乙酰CoA 羧化酶的辅助因子，生物素限量时，就会 抑制脂肪酸的合成，从而导致膜结构的不 完整。
青霉素
诱变育种的基本过程：
选择选择合适的出发菌株 ↓
制备待处理的菌悬液 ↓
诱变处理 ↓
筛选 ↓
保藏和扩大试验
钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是我国味精行业生产上的重要菌种。 二者融合子F263.
S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学
作业：列 表 比 较
菌种
形态 培养 生理 生产 特征 特征 特性 特性 其他
北京棒杆菌
钝齿棒杆菌
天津短杆菌
文献导航
http://www.authormapper.com/search .aspx?q=Corynebacterium%20crenatu m
★ 马铃薯块：培养15d仍不生长。
天津短杆菌(T613)的形态和生理特征 (3) 生理特征 ★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长良好，75 ℃ 处理10min不再生长。 ★ pH的影响： pH6~10生长良好， pH5生长微弱， pH4和pH11已不能生长。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 不水解淀粉。 ★ 不分解纤维素。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。
谷氨酸棒杆菌C. glutamicum
基因特征
GC含量类E.coli，分类属于革兰氏阳性菌 策略：
全序列测序 注释蛋白信息 分析异同 克隆谷氨酸合成相关基因
谷氨酸生产菌株形态及生理共性
细胞为球形、棒形或短杆形 革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动 都是需氧型 微生物 都是生物素缺陷型微生物 脲酶强阳性 不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶等 发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化 CO2固定反应酶系活力强 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱 α－酮戊二酸氧化能力缺失或微弱 还原型辅酶Ⅱ进入呼吸链能力弱 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强 能利用醋酸，不能利用石蜡 具有向环境中泄漏谷氨酸的能力 不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上
★ 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色， 表面湿润、光滑，隆起， 边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。
★ 普通肉汁液体培养：浑浊，没有菌盖，表面沿管壁有一圈菌膜，底 部有棉絮状和粒状沉渣。
★ 普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长较弱，且不向四 周扩散。
★ 明胶穿刺培养：表面发育良好，沿穿刺线生长不明显，不液化明胶。
磷酸甘油
油酸 生物素
C16酸 C18酸
脂肪酸 乙酰CoA
磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛
表活剂
乙酸 柠檬酸
油酸－ G途径 石蜡途径
甘油缺陷部位
表活剂拮抗部位
酮戊二酸 L-GA
细菌谷氨酸排泄控制部位
葡萄糖
葡萄糖
L-GA
R1－＝C－O－CH2
O
O
R2－＝C－O－CH
O
甘油
＝
H2C－O－－P－O－R3
O
脂肪酸
特征
1.1 棒状杆菌属(Corynebacterium)
直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八” 字形或栅状排列。 G+
1.2 短杆菌属(Brevibacterium)
短的不分枝直杆菌。 G+
1.3 小杆菌属(Microbacterium)
杆状，与棒杆菌相似。 G+
1.4 节杆菌属(Arthrobacterium)
3 天津短杆菌(T613)的形态和生理特征
(1) 形态特征 典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。不运动。无芽孢。
天津短杆菌(T613)的形态和生理特征
(2) 培养特征
★ 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状、隆起， 浅黄色，表面湿润、有光泽，不透明，不产生水溶性色素。
出发菌株：
(1)要有一定的目标产物的生产能力 (2)对诱变剂敏感 (3)生产性能好，如生长快、营养要求低、
产孢子多且早，最好是生产上自然选育 的菌株。
举例：
根据代谢工程的基本原理,对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TWQ080进行逐级诱变处理,最终选育出一株谷氨酸产生菌 GW46-4。然后对其摇瓶发酵条件及7L罐发酵条件进行了优化,最后又对 出发菌株和突变菌株的代谢流量进行了分析。主要研究内容和结论如 下： (1)以本实验室保藏菌株谷氨酸棒杆菌TWQ080为出发菌株,经过紫 外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理,以高浓度糖、高浓度味精 和琥珀酸为唯一碳源的平板进行定向筛选,最终选育出一株谷氨酸产生 菌GW46。然后对该菌株进行了耐高温驯化,驯化过程中不断提高培养温 度,经过多次驯化,育得一耐高温菌株GW46-4,在未经优化的条件下产酸 92.5g/L,比出发菌株提高了31.2%。 (2)对菌株GW46-4的种子培养基及培 养条件进行了优化,发现最佳种子培养基配方：葡萄糖25g/L、玉米浆 30g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、尿素6g/L、硫酸镁0.4g/L；最佳培养条件： 初始pH 7.0,装液量30mL/250mL。
北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征 (3) 生理特征 ★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长良好，不耐高温，41 ℃ 生 长较弱。 ★ pH的影响： Ph5~10均能生长，最适 pH6~7.5。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 ★ 不水解淀粉。 ★ 不分解纤维素。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。
氨基酸发酵工艺学
3 谷氨酸生产菌的特征、育 种及扩大培养
关键词提示
菌落形态、菌体形态 重要生理特征 育种策略 谷氨酸生产菌种制备
第一节 谷氨酸生产菌
棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)
棒杆菌属 Corynebacterium
小杆菌属
北京棒杆菌 C. pekinense 钝齿棒杆菌 C. crenatum 谷氨酸棒杆菌 C. glutamicum 百合棒杆菌 C. lilium 美棒杆菌 C. callunae 力士棒杆菌 C. herculis 嗜氨小杆菌 Microbacterium ammoniaphilum
2 钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征
(1) 形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征
(2) 培养特征 ★ 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，近草 黄色，表面湿润、无光泽，无黏性，不产生水溶性色素。 ★ 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色， 表面湿润、光滑，无 光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。 ★ 普通肉汁液体培养：稍浑浊，表面有薄菌膜，底部有较多沉渣。 ★ 普通肉汁琼脂穿刺：表面及沿穿刺线生长，且不向四周扩散。 ★ 明胶穿刺培养：表面及沿穿刺线生长。不液化明胶。 ★ 马铃薯块：培养三周仍不生长。