荧光光谱分析实验讲义

实验荧光光谱分析

一、实验目的与要求：

1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用；

2. 掌握荧光分光光度计的工作原理；

3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。

二、基本概念

1. 发射光谱

是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。

发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。

2. 激发光谱

是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。

激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。

3. 余辉衰减曲线

是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。

三、测试仪器

激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。

从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。

光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。

四、样品制备

液体试样

液体试样应放入专用的液体样品槽中，固定到样品座中。

五、测试过程

（一）RF-5301PC荧光分光光度计测试发射、激发光谱及余辉衰减曲线步骤

先开机：打开Xe灯开关和主机开关。开电脑。双击电脑桌面的“RFPC”程序快捷键进入测试程序，会出现初始化界面，仪器依次检测ROM、RAM、EEPROM激发狭缝、发射狭缝、激发单色器、发射单色器和基线，初始化完成后，进入到测试界面。

1. 发射光谱的测试

第一步：参数设置。

点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：

(1) 第一行为光谱类型。选择“Emission”发射光谱

(2) 第二行为激发波长。输入激发波长

(3) 第三行为发光波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长（对于未知样，也可选择可见光全波段400~760nm）

(4) 第四行为记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值

(5) 第五行为扫描速度。由快至慢有6种速度选择

(6) 第七行为狭缝宽度。可分别选择激发和发射狭缝宽度，对于发光较弱的样品，测试时可以适当增大狭缝宽度。

(7) 第八行为测试灵敏度选框。

(8) 第九行为响应时间选框，由快至慢有9种速度选择

(9) 参数设置完成后，点击“OK”。

第二步：光谱测试。

点击屏幕右下角“Start”按钮，开始发射光谱测试。测试完成后，屏幕会自动弹出一个保存界面：上栏可输入文件名称，下栏可输入注解，若输入注解，则该注解将会在打印出的报告中显示出来。输入文件名后，点击“Save”保存。

注意：这种保存只是临时保存，关机后将消失。永久保存需使用File / Save as，选择存储路径和文件夹，点击“Save As”保存。保存后的文件，扩展名是“.SPC”，只能用“RF-5301PC”程序打开。若想将测试结果转换为数据，以利于使用其他软件作图和编辑，需进行数据转换。

第三步：自动寻峰。

对于测试所得的发射光谱，程序能够进行自动寻峰。

步骤是：点击Manipulate 操作/ 选择Peak pick / 鼠标左键点住屏幕下方弹出的窗口，上拉，调整窗口大小，即可读出峰值。

第四步：数据转换。

点击File / Data translation / AscII Export / 则询问转换哪个通道？选择通道后，点击OK，则数据转换过程完成。

转换后的扩展名为“.ASC”的文件自动保存在了C盘 / RFPC 文件夹 / Data 子夹中。

第五步：数据处理。

打开Origin软件，点击工具菜单中的“导入ASC码文件” 快捷键，按照路径寻找我们刚刚转换的扩展名为“.ASC” 的文件，点击“打开”，则数据被导入。

点击屏幕下方的“直线”工具，即可完成作图。调整横、纵坐标的字号。输入横、纵坐标名称和单位。数据处理完成后，可直接复制到Word文件中。

2. 激发光谱的测试

第一步：参数设置。

点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：

(1) 在光谱类型选框中，选择“Excitation”激发光谱，选择后，下面几行选项随之变化。

(2) 第二行为监测的发光波长。通常，选择发射光谱的峰值位置作为监测波长。

(3) 第三行为激发波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长（通常终止波长应小于发射光谱的短波边，但允许有适量交叉）

(4) 以下“记录范围”、“扫描速度”、“狭缝宽度”、“灵敏度”及“响应时间”的设置，与发射光谱测试时的设置相类似。

(5) 参数设置完成后，点击“OK”。

第二步：光谱测试。

点击屏幕右下角“Start”按钮，开始激发光谱测试。测试完成后，自动寻峰、数据转换、数据处理的操作与发射光谱相类似。

3. 余辉衰减曲线的测试

第一步：参数设置。

点击“Acquire Mode”，在下拉菜单中选择“Time Course”模式，进行测试参数设置。其中，参数设置对话框上半部分：激发波长、监测发光波长、狭缝宽度、灵敏度、响应时间及记录范围的设置与发射光谱、激发光谱测试时的设置相类似。参数设置对话框下半部分：反应时间是指余辉衰减曲线的测试时间，即横坐标的扫描时间段；时间模式可选自动或手动；时间单位默认为秒。参数设置完成后，点击“OK”。

第二步：余辉衰减曲线测试

点击屏幕右下角“Start”按钮，开始余辉衰减曲线的测试。测试完成后，