核酸分子杂交和核酸探针检测
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
分子生物化学检验分子杂交的基本原理和核酸探针的种类
杂交（hybridization）：将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交。
变性（denaturation）：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，形成无规则线团，这一过程称作变性。
融解温度（melting temperature Tm）：在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点被称作融解温度。
复性（renaturation）：变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。
退火（annealing）：将反应体系的温度降低至寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40℃～70℃），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。
成核作用（nucleation）：两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链，如果局部双链周围碱基不能配对，则迅速解离，重新碰撞直到找到正确的互补序列。
拉链作用（zippering）：在成核的基础上，两条单链的其余部分碱基迅速互补配对，就像“拉链”那样形成完整的双链分子。
Cot1/2：表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之积，与复性速率成反比。
核酸分子杂交（molecular hybridization）：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体（hybrid）的过程。
杂交分子：不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子。
利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。
探针（probe）：探针是用放射性核素或非放射性物质标记的一段单链或双链核苷酸，可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进行杂交，以探测它们的同源程度。
广义的探针：所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。
核酸探针则特指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。
核酸杂交技术全解
（二）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与 DNA分子之间的杂交。 可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒 和噬菌体的分析等。
（二）Southern印迹杂交
包括两个主要过程： 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）。 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的 温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
Southern印迹
凝胶中DNA分离带
凝胶中DNA 的NaOH变
性
探针杂交带曝光显 影
Southern杂交的应用
应用 单基因遗传病的基因诊断
基因点突变的检测
临床应用－－用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病
(4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNA探针的标记 (7) RNA探针的标记
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保 留 5’→3’DNA 聚 合 酶 活性,弱3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
根据杂交探针标记 • 同位素杂交 • 非同位素杂交
根据杂交介质 • 液相杂交 菌落杂交
Southern印迹杂交 • 固相杂交 Northern印迹杂交
点杂交 • 原位杂交 狭缝杂交
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相，原位杂交） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）是指将两个不同来源的核酸分子（通常是DNA 或RNA）在一定条件下使其结合成为一个杂交分子的过程。
在这个过程中，核酸的碱基序列会通过氢键相互配对，形成一个稳定的复合体。
以下是一些与核酸分子杂交相关的名词解释：
1.探针（Probe）：探针是一段已知的DNA或RNA序列，它可以与目标DNA或RNA的互补序列结合，因此被用作检测特定序列的工具。
2.靶标（Target）：靶标是待检测的DNA或RNA序列。
它可以是来自任何生物样品的核酸分子，例如细胞、组织或血液样品。
3.杂交化（Hybridization）：杂交化是指将探针DNA或RNA与目标DNA或RNA在一定条件下结合的过程。
通常，在一定的温度和盐浓度下，两种核酸分子会通过氢键结合在一起，形成一个双链结构。
4.热变性（Denaturation）：热变性是指在高温和低盐浓度条件下，DNA或RNA双链分子被解开为单链的过程。
这个过程可以使探针和目标分子分离，从而结束杂交化反应。
5.比较杂交（Comparative Hybridization）：比较杂交是指将两个不同来源的核酸分子分别标记为不同的颜色，然后同时与同一标本进行杂交，从而检测它们在目标DNA或RNA样品中的相对丰度。
6.荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）：FISH是一种使用荧光标记的DNA或RNA探针对细胞核内的DNA或RNA进行检测的技术。
该技术通常用于检测染色体异常、基因突变和病毒感染等细胞水平的问题。
三种核酸检测方法
三种核酸检测方法核酸检测是一种常用的生物分子检测方法，可用于检测病原体感染、基因突变、肿瘤等。
目前有多种核酸检测方法，其中较为常见的有PCR法、核酸杂交法和全基因组测序法。
PCR法是一种基于聚合酶链反应（PCR）的核酸检测方法。
PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，通过在核酸样本中加入适当的引物和酶，使DNA片段在特定条件下反复扩增，从而达到检测目的。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于临床诊断和科研领域。
在病毒感染检测中，PCR 法可根据病毒基因组序列设计引物，通过PCR扩增出病毒核酸片段，并通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法进行检测。
核酸杂交法是一种基于互补碱基配对的核酸检测方法。
核酸杂交法通过将待测核酸样本与标记有特定probe的探针进行杂交反应，通过探针与目标核酸序列间的互补配对来检测样本中是否存在特定的核酸序列。
核酸杂交法可用于检测基因突变、病原体感染等。
其中，原位杂交法可用于细胞或组织中特定基因的检测，而Southern blotting法可用于检测DNA序列的存在与表达。
全基因组测序法（WGS）是一种高通量测序技术，可获得样本中所有基因组的完整序列。
全基因组测序法通过将待测核酸样本分解为小片段，并进行高通量测序得到序列数据，然后通过计算和比对找出样本中的基因组序列与变异。
全基因组测序法具有高度综合的优点，可以同时检测样本中所有基因和变异，并且对新型病原体的检测和研究起到了重要作用。
这种技术广泛应用于基因组学研究、肿瘤遗传学、人类基因组计划等领域。
综上所述，PCR法、核酸杂交法和全基因组测序法是三种常用的核酸检测方法。
它们分别适用于不同的检测目的和需求，具有各自的特点和优势。
随着生物技术的不断发展，核酸检测方法也在不断创新和改进，为临床医学和科研提供了可靠的工具。
分子诊断学之核酸分子杂交技术-医学检验
» 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未 知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合 ，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置 或大小显示出来。
» 探针( probe )
带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 Institute of Genetic Engineering
分子克隆基本过程：
切 转
分 切 接
筛
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
分子诊断学
核酸分子杂交技术
Nucleic Acid Hybridization Technology
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
影响复性速度的因素：
DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
Institute of Genetic Engin1e7ering
二、核酸分子杂交的技术原理
在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中， 或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在 不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
检测对象: 克隆化的基因组DNA，细胞总DNA、总RNA
。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细 胞内杂交, 即细胞原位杂交。
核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、特异性
应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的基本原理是互补配对。
DNA由四种碱基组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
在DNA的双链结构中，A总是与T互补，G总是与C互补。
RNA的组成与DNA类似，但胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
1.样品制备：将待检测的核酸提取和纯化，通常使用的方法有酚/氯仿法或商用试剂盒。
2.样品标记：将一条核酸链标记上荧光物质或放射性同位素，以便于后续的检测和可视化。
标记通常使用DNA或RNA标记试剂盒来完成。
3.杂交：将待检测的样品核酸与已知碱基序列的探针核酸杂交。
探针核酸是一条已知序列的DNA或RNA，在实验中作为参照物。
杂交条件包括温度、盐浓度和时间等。
4.杂交后处理：将杂交的核酸片段进行洗脱和处理，以去除未杂交的核酸。
这可以通过水洗、盐洗或酶处理等方法来完成。
5.分析和检测：通过荧光显微镜、放射计数器或PCR等方法来检测和分析杂交的核酸。
可以测量荧光强度、放射性计数或扩增产物的数量等，以确定核酸的相互作用或特定序列的存在。
核酸分子杂交技术在生物医学研究和诊断中具有广泛的应用。
例如，它可以用于检测病毒感染、基因突变、基因表达差异以及遗传性疾病的诊断等。
此外，核酸分子杂交还可以用于基因组和转录组的分析，帮助科学家理解基因调控、进化和物种间关系等重要生物学问题。
综上所述，核酸分子杂交技术基于互补配对原理，通过使两条互补的核酸链结合，来研究DNA和RNA的相互作用和序列特征。
它是一种重要的实验技术，在生物医学研究和诊断中得到广泛应用。
核酸分子杂交实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸分子杂交的基本原理和方法。
2. 学习使用核酸探针进行DNA/RNA的定性或定量分析。
3. 了解核酸分子杂交在生物学研究中的应用。
二、实验原理核酸分子杂交是利用核酸分子间碱基互补配对原理，将带有标记物的已知序列的核酸片段（探针）与待测样品中的DNA/RNA进行杂交，形成具有互补序列的双链分子。
根据杂交双链的形成，可以检测待测样品中是否存在特定的基因序列。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待测DNA/RNA样品- 核酸探针- DNA变性剂- DNA/RNA结合缓冲液- 标记物（如放射性同位素、荧光物质等）- 琼脂糖凝胶- 电泳仪- 显影设备2. 实验仪器：- 研钵- 烧杯- 移液器- 离心机- 微量移液器- 火焰消毒器- 显微镜四、实验步骤1. 准备探针：将标记好的核酸探针稀释至适当浓度。
2. DNA变性：将待测DNA/RNA样品与DNA变性剂混合，在沸水浴中变性5分钟。
3. 冷却：将变性后的样品迅速冷却至室温。
4. 核酸杂交：将变性的待测DNA/RNA样品与探针混合，在适当温度下进行杂交反应。
5. 电泳分离：将杂交反应后的样品进行琼脂糖凝胶电泳分离。
6. 显影：使用放射性同位素或荧光物质等标记物进行显影，观察杂交结果。
五、实验结果与分析1. 结果：在凝胶上观察到明显的杂交条带。
2. 分析：- 杂交条带的出现表明待测样品中存在与探针互补的核酸序列。
- 杂交条带的亮度与待测核酸序列的浓度成正比。
六、实验讨论1. 实验过程中，DNA变性剂的选择和变性时间的控制对实验结果有重要影响。
2. 探针的选择和标记方法对杂交结果也有较大影响。
3. 电泳分离过程中，电泳缓冲液和电压的选择对分离效果有影响。
4. 核酸分子杂交技术在生物学研究中具有广泛的应用，如基因诊断、基因治疗、基因表达分析等。
七、实验结论通过本次实验，我们掌握了核酸分子杂交的基本原理和方法，了解了核酸探针在DNA/RNA定性或定量分析中的应用。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
19
根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
核酸探针
核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由
于具有互补序列，在一起复性时，互补 序列配对，形成杂化分子。
+ +
14
15
16
二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑
17
4. 杂交液中的甲酰胺
甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：
45
1. Southern 印迹杂交 主要步骤：
46
纯化的待测DNA样品 限制性内切酶酶切后（EDTA， 65℃灭活限制酶） 琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 变性液（碱变性）
凝胶上DNA变性
Tris缓冲液 中和 高盐下
预杂交 杂交 放射自显影 结果分析
47
DNA转印至NC膜
烘干、固定
48
southern印迹
3
DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
4
5
解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
28
2. 特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱 基配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
29
3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用 [α-32P]dNTP取代原来 DNA链 中不带同位素的同种核苷酸，生成的两 条链均被同位素标记。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术发展，使对某些疾病诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速目。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接证据随着分子生物学发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制及流行病学规律等方面一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术原理，核酸分子杂交方法及核酸探针应用等方面。
一、核酸探针技术原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因DNA 片段，能及互补核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间氢链被破坏而变性，解开成两条互补单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)条件下才能实现。
正是由于双链DNA这种可解离及重组合性质，才可用一条已知单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，及另一条固定在硝酸纤维素滤膜上变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链及核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无及探针DNA (或RNA)同源或部分同源DNA(或RNA)存在。
因为探针只及靶病原体DNA或RNA杂交，而不及标本中存在其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好探针进行杂交，探针便可找出已固定DNA中互补序列，及之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。
然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。
时间越长，产量越高。
延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。
应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。
且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng 2650ng(2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。
两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。
核酸分子杂交的概念基本原理探针及类型
核酸分子杂交的概念、基本原理、探针及类型分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA 变性：1、D NA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。
（二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization ）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA ），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。
利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
二、分子杂交基本原理：（一）DNA 变性：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。
1、D NA变性的方法：1）加热；2）改变DNA溶液的pH ；3）有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。
2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。
在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect ）。
利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。
3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。
4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature ，Tm ）。
因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。
5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：1）部因素：pH、离子强度。
随着溶剂内离子强度上升，Tm 值也随着增大。
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
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B. Northern blot杂交
Northern blot杂交的原理与Southern blot杂 交基本相同。所不同处在于，RNA远不如DNA 稳定，很容易被RNA酶降解，而RNA酶不仅广 泛存在，而且加热至100℃也不能使其灭活， 所以在操作RNA时所用的一切器皿和溶液都必 需经过严格的消除RNA酶的处理。另外，RNA 的电泳必须在含甲醛或乙二醛的变性凝胶中进 行。Northern blot杂交主要应用于检测癌基因 或基他肿瘤相关基因的过度表达，也可检测抑 癌基因的低表达或不表达。
DNA/RNA核酸分子杂交
4. 核酸探针
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷 酸序列,这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技 术─探针(probe)的制备。探针是指带有某些标 记物(如放射性同位素32P,荧光物质异硫氰酸荧 光素等)的特异性核酸序列片段。若我们设法使 一个核酸序列带上32P,那么它与靶序列互补形 成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接 受来自杂交链的放射信号,即可对靶序列DNA 的存在及其分子大小加以鉴别。核酸分子杂交 作为一项基本技术,已应用于核酸结构与功能研 究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传 性疾病的基因诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的 基因分析,传染病病原体的检测等领域中,其成 果大大促进了现代医学的进步和发展。
核酸分子杂交和核酸探针检测
核酸分子杂交的分子生物学基础 核酸分子杂交的方法 核酸分子杂交及探针技术的应用
核酸杂交的分子生物学基础
变性(denaturation)和复性(renaturation) 是 双链核酸分子的二个重要物理特性。也 是核酸研究中经常引用的术语。双链 DNA,RNA双链区,DNA: RNA杂种双链 (hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分 子(heteroduplex) 都具有此性质。
1. DNA的变性：
指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无 规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋 稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部 分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA 变性不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双 螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如 加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素 及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子 变性。变性能导致DNA 以下一些理化及生物 学性质的改变。
5 核酸分子杂交的种类Fra bibliotekA. Southern blot杂交
将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同 长度的DNA片段，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，如加 样量相等，酶解适当，则在用溴化乙锭染色时，应显示长度 及亮度均相等的DNA拖带。电泳后的凝胶须经碱变性处理， 使DNA解离成单链，然后用毛细管虹吸法或电转移法，使凝 胶上的单链DNA片段，按凝胶上相同的位置转移到硝酸纤维 素膜或尼龙膜，经适当洗涤、凉干后，在80℃烤箱中加温2小 时，即可用于杂交。用于检测DNA的已知探针，一般由带有 该片段的细菌质粒中制备。纯化的探针DNA一般用放射性同 位素32P或生物素、地高辛配基等标记。杂交前探针必须加温 至100℃变性处理。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后， 即在一定的位置显示同标记探针特异地结合的阳性DNA条带。 Southern blot杂交法可检测癌基因的存在及其扩增，也可检测 抑癌基因的杂合性丢失。
核酸分子杂交的过程
单击显示 核酸分子杂交法原理 核酸探针的种类 核酸探针的标记和检测 核酸分子杂交方法
3. 核酸分子杂交
分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸 研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就 是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不 同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂 交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在 DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间 形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核 酸链实现复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成 为单链,因此,变性技术也是核酸杂交的一个环 节。
2 . DNA的复性：
指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全 部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变 性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷 却后即可复性,此过程称之为" 退火 "(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸 分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影 响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。