(优选)生物分离工程三版

凝胶浓度：
Tg
a b 100% m
交联浓度：
cg
b 100% ab
a －丙烯酰胺单体质量； b －交联剂单体质量； m －缓冲液质量；
凝胶中的电泳速度
当一定交联浓度时，聚丙稀酰胺凝胶中电泳 迁移速率和凝胶浓度之间有如下关系
log u log u0 K rTg
Kr 为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数； u0 为外插到Tg＝0时的迁移率；
等速电泳的原理
在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离 子（一般为强电解质离子，Cl-）；迁移率最小的阴 离子为末尾离子（一般为甘氨酸）；
电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导 离子和末尾离子之间；料液区的pH值高于前导离子 区的pH值；
在前导离子区，前导离子的浓度与反离子的浓度一 定时，由于pH值不变，其泳动速度为一定值；
识记：电泳、迁移率、电渗流概念 理解：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的
电泳速度
电解质在电场中运动
＋
－
阴离子 阳离子
自由溶液中电泳速度
荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的 荷电荷数z及电场强度E成正比，其表示为
f E Ze
荷电溶质在自由溶液中受到的阻力f’为
f ' 6 rve
当两者之间达到平衡后，
凝胶电泳原理
原理
在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中的 泳动速度是不同的。相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用 较大，泳动速度慢；相反，分子量小的溶质泳动速度较快。 经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝 胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。
凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液 中溶质的相对分子量而异。
凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。
不连续凝胶电泳形式
不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组 成。
上层凝胶浓度在2-3% Tg，其凝胶孔径很大，凝胶对 溶质的泳动基本上无阻滞作用，表现为等速泳动， 溶质在此层得到浓缩；
下层凝胶浓度在5-25% Tg ，凝胶具有一定的孔径， 各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此， 上层称为浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离 胶。
电色谱
电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分 离方法 电泳色谱(electrophoretic chromatography)
将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合
电色谱(electrochromatography)
利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质 在固定相和流动相间的分配平衡特性
基础理论
电解质溶质迁移率
f f'
eZE
ve 6 r u0E
真实电泳速度
在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的 表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。
当荷电溶质的表面电位（φ0）很小时，电位
沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函 数表示，
0ex
1
1
2
kBT
103 e2
NI
2
真实电泳速度
电渗流速度
电渗流是荷电固体表面诱导的双电层中反离 子在电场作用下发生定向迁移引起的。
电渗流可用下式表示：
v0
w E L
+
-
凝胶电泳－学习要点
理解：凝胶电泳原理，等速电泳的原理特点， 以及分离操作和分离特性
凝胶电泳－定义
凝胶电泳是利用凝胶分子筛作用使分子大小 不同的电解质得到分离的电泳分离方法。
考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的 迁移率变为
eZf r u0 6 r 1 r
r 1 r 1
f r 1.5
f r 1
u0
eZ
4r 2
u0
eZ
6 r
凝胶浓度的表示法
电泳分离中常用的聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀
酰胺单体和交联剂N, N’-甲叉双丙稀酰胺在催
化剂和引发剂的作用下共聚调制，凝胶浓度 可用如下公式表示
提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩； 采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白
质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白 质完全分离；
不连续凝胶的分离操作
不连续凝胶层的上部和下部分别使用pH值不同 的缓冲液，其中上部缓冲液根据待分离蛋白质等电点 选定。
上层浓缩层采用pH 6.8的缓冲液，下层分离层采用pH 8.3的缓冲液；
调节凝胶浓度可改变迁移率；
外加电压
等电点聚焦－学习要点
理解：等电点聚焦的原理及特点
等电点聚焦定义
等电聚焦是利用蛋白质和氨基酸等两性电 解质具有等电点，在等电点的pH值下蛋白质 呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离的ຫໍສະໝຸດ Baidu方法。
形成连续梯度的化合物
IEF的关键是调配稳定的连续pH值梯度，一般采 用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其带有许多正负电 荷，这类物质具有与蛋白质相近似的等电点范围，缓 冲能力强，pH值梯度稳定。其结构如下
（优选）生物分离工程三版
电泳及电泳分离
电泳 电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生 定向泳动的现象。
电泳分离 利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分 离的方法，称为电泳分离。
电泳分类
根据电泳原理分类 区带电泳； 等电点电泳（等电聚焦）； 等速电泳；
根据电泳载体分类 凝胶电泳； 自由流电泳；
末尾离子根据其处位置的pH值所产生的解离度和离 子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷） 移动；
等速电泳的原理(续)
料液中移动速度最快的组分A（pH高）首先进入前 导离子区，但由于前导离子区pH值较低，溶质的解 离度减小（所带负电荷变少，pH降低），泳动速度 减慢。因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导 离子区和混合料液区交界处组分浓度增加；
同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液pH值降 低；
在此降低的pH值下，其它组分不能与组分A以相同 的速度泳动而拖后；
随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区 带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓度相应 的pH值。
等速电泳的特点
各个组分间形成相互连接的独自区带，显示 各自与对离子相应的pH值；
上层中，料液中蛋白质夹在前导离子和末尾离子之间 在浓缩层内等速泳动，达到等速电泳状态后进入下层 分离凝胶；
下层中蛋白质受到高浓度凝胶的分子筛作用，末尾离 子会超过蛋白质，蛋白质依据荷电量和分子大小分离；
影响不连续凝胶分离的因素
缓冲液的pH值、组成
调节pH值可以改变荷电量Z；
分离胶的浓度或交联度