石蜡切片法
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石蜡切片的主要过程
取材——固定保存——冲洗——脱水—— ——透明——石蜡透入——包埋——修 块——切片——贴片——复水——染色— —脱水——封藏——观察保存
(一)包埋
(二)修块、切片、贴片
(三)染色、封藏
一、实验材料及用品
实验材料:植物叶片、小鼠肝脏
实验用具:载、盖玻片;温箱、包埋盒、水盆 等、切片机、毛笔等。 实验药品:石蜡、蛋白黏贴剂。
苦味酸液(波茵氏液)
甲液: 1%铬酸 10%醋酸 乙液: 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
是常用的良好固定液,广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊 椎动物的卵和幼虫,以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的 雌配子体和被子植物的胚囊的固定。
此液穿透迅速而均匀,使组织收缩少,不使组织变硬变脆,着色良 好。一般动物组织固定12—24h,小块组织数小时即可。固定后直接 入70%酒精中洗去黄色,但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料 的固定时间为12—48h。
切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 :
一、蜡带弯曲不直 原因:1.蜡块上下两边不平行,或与刀口不平行;2.刀口锋利不一,局 部产生差异;3. 材料未居蜡块正中央。
补救办法: 1.取下台木,将蜡块两边修平,调节夹物部,使两者平行。 2.移动刀片,改用新刀口。3. 用刀片切去部分石蜡,使材料居中。
二、实验步骤(4)
修块:削去表面的包埋剂,露出组织,然后在组织的四周以和水平 面成45度的角度削去包埋剂,修成金字塔形,顶面修成梯形或长方 形,每边的长度为0.2mm~0.3mm ;
修块的目的: 1)使切成的蜡带成一直线,不发生弯曲; 2)每个切片组织的距离接近,便于镜检或作连续切片。
要求:组织块必须 ①上下平行,② 但左右的蜡、上下的蜡不要
浸蜡: 要点:使石蜡完全浸入细胞的每个部分,同时要使石蜡紧密地贴在细胞 壁的内外,成为不可分离的状态; 原则:低温 高温、低浓度 高浓度
二、实验步骤(3)
包埋:就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸 盒中,使之凝固。
包埋前折纸盒 包埋时将纸盒放在已经加热的温台上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯, 倒入包埋用的纸盒中,取出存放材料的蜡杯,迅速且轻轻地用温镊子夹 取材料平放于纸盒底部(注意切面朝下放置),再用温镊子轻轻拨动材 料,使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起,慢慢平放于水盆 的水面上,待蜡盒内的石蜡表面凝固,即可将纸盒向一侧倾斜,使冷水 从一边浸入纸盒,并立即使它沉如水中,使盒中包埋块迅速凝固,待石 蜡完全凝固(约30min)后即可取出备用。
来自百度文库
三、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状,蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求?
修块效果:每个蜡边与材料平行,蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果:得到厚薄均匀的蜡带,蜡带无破损。 展片效果:展片后蜡带或蜡片平整,无气泡、粘附牢 固,蜡带略呈透明状,后续制片不易脱落。
脱水(常用脱水剂:乙醇;脱水原则:低浓度到高浓度)(目的?) 脱水时间:视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏:在各级AL中停留0.5-1h; 植物叶片:在各级AL中停留2-4h; 注意:脱水应彻底,否则与二甲苯混合后混浊,必须倒回重脱水;如需过夜, 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤(2)
透明(置换) 常用透明剂:二甲苯; 透明原则:低浓度到高浓度 (½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯) 透明时间:小鼠肝脏每级停留0.5-1h;植物叶片每级停留1-3h。
原因:1.室温过低。2.石蜡过硬。3.材料边缘留蜡太少。4. 刀的角度不 合适。 补救办法: 1.在切片机上安一盏电灯加温。2.用手指在蜡块面上磨擦。 3.重新包埋。4.矫正刀的角度。 原因:1.室温过高。2.石蜡过软。3.刀口上留有一层石蜡。4.刀口钝。 补救办法: 1.在早晚凉爽时切。2.将蜡块投入凉水中稍浸。3.用二甲苯 拭去石蜡。4.磨刀或移动刀口。
二、切片分离,不能连成带状或卷起成圆筒状。
三、切片粘附于刀片上,皱褶在一起。
切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 : 四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。
原因:1.刀口有缺口;2.石蜡块中有颗粒及杂质;3.刀口有细纤 丝或碎屑;4.刀和台木未夹紧;5.组织块太硬。 补救办 法: 1.可移动刀片;2.将颗粒挑去;3.清洁刀口;4.旋 紧螺旋;5.在水中浸泡。
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题:包埋后的石蜡块应为均匀半透明状,有时出现白色浑浊 结晶(像雪花一样)部分,这样在切片时就有妨碍,不易切出 薄的切片。 原因:①组织内部或石蜡中混有透明剂;②脱水不干净;③石 蜡本身品质不良;④组织块移入纸盒时动作太慢,周围的石蜡 已成凝固状态;⑤冷却用水温度不够低,石蜡凝固太慢。 解决办法:属于前三个原因者应在包埋之前就须注意;属于后 二个原因者,可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋,但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法,除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用,既 可制成较薄的切片,使材料各部分都清晰可见,同时也
可制成连续切片,观察材料的动态发生及层次,所以,
它在显微制片技术中占有非常重要的地位,必须掌握, 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。
二、实验步骤(6)
切片的步骤:
将已经修整好的蜡块装在样品固定器上,并固定好; 将切片刀安装在切片机的刀架上,调节切片刀的角度为15°左右,并固 定好; 调节切片的厚度:棉花叶片:8-10um;小鼠肝脏:6-9um; 调节蜡块与刀口的距离:打开刀架固定钮,推动刀架,使切片刀刃贴近 蜡块表面(从侧面观察),再固定刀架; 切片:打开停刀轧,开始切片,右手握住手轮柄,顺时针方向摇动,每 摇动一圈就切下一片,切下的蜡片粘在刀口上,待第二片切下时就连在 一起,连续摇转手轮就可以讲切下的蜡片练成一条蜡带。待蜡带有一定 长度,左手执毛笔,将蜡带抬起,边摇边移动蜡带。待蜡带长至2030cm,停止摇动,用右手执另一支毛笔顺刀口方向拔下蜡带,平放于 白纸上,靠刀面较光滑面向下,较皱褶的一面向上。
五、材料出现裂隙、破碎或脱落。
原因:1.脱水不干净;2.透明剂残留;3.石蜡透入时温度过高; 4.材料太硬或太粗。
补救办法: 1.无法补救;2.重新包埋;3.无法补救;如由于脱 水剂,透明剂引起的可改用正丁醇,松油醇等进行脱水和透明; 4.软化组织。
二、实验步骤(7)
贴片:
要求:1)贴附牢固,在染色时不易脱落;2)使皱褶的蜡片伸展平整 步骤: 1)在载玻片上涂上蛋白黏贴剂;
染色原理--化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂,而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时,就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合,当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时,就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如,细胞核,尤其是核内的染色质,主要由核酸组成,是酸 性的组成成分.故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强,易于 着色。细胞质含碱性物质,故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大,易于着色。
常用染色剂分类
按染料的化学性质可分为 :碱性染料 、酸性染料 、直接染料 、媒染 染料 、中性染料; 根据染料的来源可分为:天然染料(此类染色剂是从动、植物体中提取 的,为天然产物,产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝 等)和合成染料(全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最 早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的,所以又称为煤焦油染料)。 根据染料的用途可分为:细胞核染色剂(用于细胞核的染色剂有天然染 色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺 蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等)、细胞质染色剂(用于细胞质 的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和 水溶性苯胺蓝等)和脂质染色剂(用于显示脂质的染色剂有合成染色剂 中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等)。
2)将已经涂好蛋白黏贴剂的载玻片放在纸面上,并滴加数滴蒸馏水;
3)用刀片将蜡带切成许多小段,每段的长度应依照盖玻片的长度为准, 一般应比盖玻片短约1/5-2/5,因蜡片加温后要伸长1/5-2/5,在分段时应 从蜡片的交界处分开; 4)用毛笔将蜡片轻轻移到载玻片上(必须注意蜡片的光面朝下); 5)将载玻片平行地放置在酒精灯的上方,微热,使切片伸展摊平,如 发现散开,请重新用镊子排列整齐; 6)晾干待用。
切片注意事项:
操作时一定要小心,随时注意关好停刀轧,以防刀夹突然下降伤 及手指,在换蜡块时,必须先关停刀轧,才能取下蜡块;
切片时不要对着蜡带讲话,要防风,以免将蜡带吹散; 根据材料要求,注意调节合适的切片厚度; 切片完毕后,将刀取下擦净,放入盒内保存,同时用毛笔清洁切 片机各部分,将刀架、夹物器等退回原处固定。
甲醛-醋酸-酒精液(FAA) 50%或70%酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点:过去称”标准固定液“或”万能固定液“;是 组织形态中常用的固定液;同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外,均可用此液固定.也通用于昆虫和甲壳 类的固定。
二、实验步骤(1)
取材(根据制片目的和要求而定,代表性); 杀死和固定: 冲洗 小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或50%AL进行冲洗; 植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗 50% 70% 80% 95% 100%AL 100%AL 小鼠利用引颈致死法迅速杀死,取其肝脏,用生理盐水冲洗干净后分割成 0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm 小块投入Bouin’s固定液中进行固定; 植物叶片采集后分割成1~1.5c㎡小块后投入FAA固定液中进行固定;
染色原理--物理作用
渗透作用:染料渗透到多孔的组织中,与组织没有牢固的结合;
吸收作用:又称溶解学说,组织吸收染料中的色素粒子,与之牢 固结合,组织着色与染液的颜色相同,不一定与干燥染料的颜色 相同。如品红在干燥时为绿色,而其溶液呈红色,组织在染色后 也呈红色,即使组织干燥后,其红颜色不变; 吸附作用:染液中分散的色素粒子进入被染物质的粒子间隙内, 由于分子的引力作用,色素粒子被吸附而染色,也由于各种蛋白 质或胶体有不同的吸附面,因此可以吸附不同的粒子,也就是说 对粒子的吸附有选择性,即有的容易被某些物质吸附,有的则不 容易吸附。
石蜡切片法
—— 染色、封藏
实验原理
切片通过不同方法,使其干燥,然后进行染色。因为每
一张载片上粘贴的是蜡带,因此必须先用二甲苯去除石 蜡再用酒精去除二甲苯,再进入水中,才能染色,染色 的方法很多,要根据每张标本要求显示的目的选择不同 的染剂,染色后显示清晰的细胞形态和核的大小,位置, 然后使带水的载片经历脱水→透明等步骤最后用树胶封 片。
脱水不净,用二甲苯透明后,将发生下列不良后果:
(1)材料:材料内仍留有微量水分,二甲苯就进不去,因此石蜡也不能透 入,切片后将在蜡片上出现空洞,影响结果。 (2)切片:切片内留有微量水分,在封片以后,就会发生乳白色的云雾状 ,在显微镜下观察时,可见许多密集水珠把组织掩盖,切片就作废了。
太多或太少;③正方形或长方形,可各切去一角,以便识别。
三、实验步骤(5)
切片:用锋利的刀片,将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片, 一般用专门的切片机和切片刀。 切片机的结构: 控制切片厚薄的微动装置; 供装切片刀的夹刀部分;
供装置组织块的夹物部分。 切片机的类型根据结构分为: 滑行式切片机:夹刀部分是滑动的,而夹物部分是固定的,可上 下升降; 旋转式切片机:夹物部分式上下移动,前后推进,而夹刀部分则 固定不变。